李 偉，林 琳，張寧潔，陳 恩，王芙艷，霍 治，余 平

(中南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系，湖南 長(zhǎng)沙 410008)

沙眼衣原體是一類(lèi)專(zhuān)性細(xì)胞內(nèi)寄生的原核微生物，為臨床上導(dǎo)致失明的主要病因之一，也是最常見(jiàn)的性傳播性疾病(Sex transmitted disease，STD)病原體，WHO報(bào)道全世界每年有約9千萬(wàn)新發(fā)STD病例是因感染Ct所致［1］。雖然Ct感染可用抗生素治療，但由于感染后癥狀常不明顯，甚至沒(méi)有自覺(jué)癥狀，往往會(huì)延誤診治，造成Ct持續(xù)感染［2］，引起尿道炎、盆腔炎、輸卵管性不孕等多種疾病，甚至與HIV感染及腫瘤也有密切關(guān)系［3-5］。接種疫苗將是預(yù)防和控制Ct感染最有效的方式，但由于對(duì)機(jī)體的抗Ct感染免疫機(jī)制了解不夠，目前尚無(wú)有效的疫苗。

Toll-Like受體(Toll-like receptors，TLRs)主要表達(dá)在具有免疫功能的組織［6］，例如:脾臟和外周血白細(xì)胞以及與外環(huán)境相通的呼吸和消化道、生殖道等，在早期固有免疫中對(duì)入侵病原微生物的識(shí)別發(fā)揮重要作用。這些進(jìn)化保守的受體可識(shí)別表達(dá)在病原微生物上的高度保守的病原相關(guān)的分子模式(Pathogen-associated molecular pattern，PAMP)，如酵母細(xì)胞壁上的甘露糖，各種細(xì)菌的脂多糖、多肽糖、胞壁酸等細(xì)胞壁成分，及鞭毛蛋白、細(xì)菌DNA和病毒的雙鏈RNA。TLRs受PAMPs刺激而啟動(dòng)包括一些蛋白(例如MyD88和IRAK)的下游信號(hào)級(jí)聯(lián)，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子NF-kB的激活，誘導(dǎo)促炎/抑炎細(xì)胞因子和直接參與適應(yīng)性免疫應(yīng)答的效應(yīng)細(xì)胞因子的分泌。

TLRs在Ct感染中的作用已被深入研究，主要集中于上皮細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)及巨噬細(xì)胞(Mφ)上的 TLRs，尤其以 TLR2、TLR4的作用最為突出［7，8］。如 Ct的 LPS 及 cHSP60 可經(jīng) TLR2 或 TLR4途徑被上皮細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞等識(shí)別，誘生IL-6、IFN-β等，進(jìn)而對(duì)獲得性免疫進(jìn)行調(diào)節(jié)［9］。目前已有的關(guān)于衣原體感染后TLRs表達(dá)變化的研究證據(jù)在不同的研究報(bào)道中并不一致，其原因可能與各研究中使用的衣原體菌株及感染靶細(xì)胞株不同有關(guān)，也有可能與所建立的感染模型不同(急性/持續(xù)性)有關(guān)，但目前尚無(wú)這方面的研究報(bào)道。

已有研究證實(shí)在Ct感染后，Ct的某些組分可經(jīng)TLRs信號(hào)通路刺激上皮細(xì)胞、抗原提呈細(xì)胞(APC)等產(chǎn)生前炎癥因子，而我們認(rèn)為在感染進(jìn)程的不同階段，TLRs在靶細(xì)胞上的表達(dá)可能隨著感染的進(jìn)程變化而變化，進(jìn)而影響前炎癥因子的產(chǎn)生，最終在免疫清除及慢性炎癥中表現(xiàn)出不同的生物學(xué)功能。我們利用Hela細(xì)胞分別建立Ct急性感染及持續(xù)性感染模型，通過(guò)熒光定量RT-PCR、ELISA等研究策略比較Ct不同感染狀態(tài)下TLR4、IL-6以及其下游STAT3表達(dá)量的變化，初步探索TLRs參與衣原體持續(xù)感染的可能機(jī)制，為Ct感染及炎癥的控制提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及試劑

人宮頸癌上皮細(xì)胞株Hela及Ct L2血清型為本室保存;IFN-γ購(gòu)自 SIGMA;DMEM、小牛血清購(gòu)自Hyclone;DEPC、Trizol、異丙醇購(gòu)自北京鼎國(guó);MMLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Fermantas;qRT-PCR試劑購(gòu)自BioRad;IL-6 ELISA試劑盒購(gòu)自R＆D。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和Ct急性感染模式及持續(xù)性感染模式的建立

(1)Hela細(xì)胞用含有10%小牛血清的DMEM在37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。參照文獻(xiàn)［9］進(jìn)行Ct感染、增殖和滴定，分裝的Ct保存在-80℃。

(2)建立急性感染模式:計(jì)數(shù)2×105個(gè)Hela細(xì)胞接種于60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，24 h后感染Ct L2血清型 (MOI=5，MOI multiplicity of infection，感染復(fù)數(shù))。感染細(xì)胞在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在感染后不同時(shí)間點(diǎn)收取標(biāo)本。

(3)建立持續(xù)性感染模式:計(jì)數(shù)2×105個(gè)Hela細(xì)胞接種于60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，接種24 h后感染Ct L2血清型 (MOI=5)，參照前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在2 h后加入100 U/mL的IFN-γ。感染細(xì)胞在37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在感染后不同時(shí)間點(diǎn)收取標(biāo)本。

1.3 熒光定量 PCR技術(shù)檢測(cè) TLR4、IL-6以及STAT3轉(zhuǎn)錄水平

分別在Ct急性感染及持續(xù)性感染Hela細(xì)胞6 h、18 h、24 h和48 h(分別代表Ct發(fā)育周期的極早期、早期、中期和晚期)后收集細(xì)胞樣本，同時(shí)收集相同時(shí)間點(diǎn)未感染細(xì)胞樣本作為對(duì)照，參照使用說(shuō)明書(shū)用TRIzol法抽提總RNA。將RNA樣本用MMLV試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，保存在-80℃。

并利用Primer2.0及Primer-Blast設(shè)計(jì)待測(cè)基因的引物(表1)用于qRT-PCR檢測(cè)mRNA表達(dá)量。所采用的qRT-PCR體系(20μL)為:

qRT-PCR循環(huán)條件如下:95℃變性2 min，后以94℃變性15 s，55℃退火15 s，40個(gè)循環(huán)，每一循環(huán)結(jié)束后記錄熒光值，擴(kuò)增完畢后繪制熔解曲線。采用△△Ct法計(jì)算各目的基因 mRNA的表達(dá)變化。使用BioRad CFX manager 2.0分析不同感染狀態(tài)下基因的差異表達(dá)情況。

表1 qRT-PCR引物序列Tab.1 The primers for qRT-PCR

1.4 ELISA檢測(cè)IL-6分泌水平

分別在Ct急性感染及持續(xù)性感染Hela細(xì)胞6 h、12 h、24 h、36 h和48 h后收集培養(yǎng)上清，同時(shí)收集相同時(shí)間點(diǎn)未感染培養(yǎng)上清樣本作為對(duì)照，分裝后保存在-80℃。用雙抗夾心ELISA方法檢測(cè)上清液中IL-6濃度。操作根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

所有資料處理均使用SPSS13.0軟件進(jìn)行分析，檢測(cè)結(jié)果以表示，組間比較采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 成功構(gòu)建Ct持續(xù)性感染模型

在前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，我們利用IFN-γ建立了Ct L2持續(xù)感染Hela細(xì)胞的模型(圖1)。

圖1 光學(xué)顯微鏡下觀察L2急性感染(acute)及IFN-γ誘導(dǎo)的持續(xù)性感染(IFN-γ-prst)的Hela細(xì)胞(姬姆薩染色，40×10)Fig.1 Observed under optical microscope:acute infection(acute)and IFN-γ-induced persistent infection(IFN-γ-prst)of L2 in Hela cells(Giemsa staining，40 × 10)

2.2 不同感染組中 TLR4、IL-6和STAT3的表達(dá)變化

利用qRT-PCR方法發(fā)現(xiàn)，L2感染后Hela細(xì)胞的TLR4轉(zhuǎn)錄水平出現(xiàn)上調(diào)，且隨著感染時(shí)間延長(zhǎng)，上調(diào)程度增加;與急性感染相比較，IFN-γ誘導(dǎo)的L2持續(xù)感染狀態(tài)下Hela細(xì)胞的 TLR4轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)改變得更為顯著(圖2)。而IL-6轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)也表現(xiàn)出相似的改變，在持續(xù)性感染狀態(tài)下Hela細(xì)胞內(nèi)IL-6轉(zhuǎn)錄水平比未感染組、急性感染組顯著增加，并呈時(shí)間依賴性增加，而且與TLR4的轉(zhuǎn)錄表達(dá)上調(diào)趨勢(shì)相一致(圖3)。STAT3的轉(zhuǎn)錄水平在持續(xù)性感染18 h明顯增強(qiáng)，之后隨時(shí)間推移轉(zhuǎn)錄水平逐漸下調(diào)，但總體轉(zhuǎn)錄水平比未感染組和急性感染組顯著增高(圖 4)。

圖2 qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)L2不同感染模式下，Hela細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)TLR4的轉(zhuǎn)錄水平mock:未感染;acute:急性感染模型;IFN-γ-prst:IFN-γ誘導(dǎo)的持續(xù)感染模型 (*P＜0.05)Fig.2 qRT-PCR detection of TLR4 transcription level in Hela cells in different pattern of L2 infection at different time points(*P ＜0.05)mock:mock infecion;acute:acute infection;IFN-γprst:IFN-γ-induced persistent infection

圖3 qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)L2不同感染模式下，Hela細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)IL-6的轉(zhuǎn)錄水平mock:未感染;acute:急性感染模型;IFN-γ-prst:IFN-γ誘導(dǎo)的持續(xù)感染模型 (*P＜0.05)Fig.3 qRT-PCR detection of IL-6 transcription level in Hela cells in different pattern of L2 infection at different time points(*P ＜0.05)mock:mock infection acute;acute infection:IFN-γprst:IFN-γ-induced persistent infection

2.3 不同感染組中IL-6分泌水平

圖4 qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)L2不同感染模式下，Hela細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)STAT3的轉(zhuǎn)錄水平mock:未感染;acute:急性感染模型;IFN-γ-prst:IFN-γ誘導(dǎo)的持續(xù)感染模型(*P＜0.05)Fig.4 qRT-PCR detection of STAT3 transcription level in Hela cells in different pattern of L2 infection at different time points(*P ＜0.05)mock:mock infection;acute:acute infection;IFN-γprst:IFN-γ-induced persistent infection

利用ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞因子分泌發(fā)現(xiàn)，L2感染后Hela細(xì)胞的IL-6分泌水平出現(xiàn)明顯上調(diào)，且隨著感染時(shí)間延長(zhǎng)，上調(diào)程度增加;與急性感染相比較，IFN-γ誘導(dǎo)的L2持續(xù)感染狀態(tài)下Hela細(xì)胞的IL-6分泌水平上調(diào)改變得更為顯著(圖4)。

圖5 ELISA檢測(cè)L2不同感染模式下，培養(yǎng)Hela細(xì)胞不同時(shí)間后上清中IL-6的濃度mock:未感染;acute:急性感染模型;IFN-γ-prst:IFN-γ誘導(dǎo)的持續(xù)感染模型(*P＜0.05)Fig.5 ELISA detection of IL-6 secretion level in Hela cells supernatant in different pattern of L2 infection at different time points(*P ＜0.05)mock:mock infection;acute:acute infection;IFN-γprst:IFN-γ-induced persistent infection

3 討論

Ct在宿主細(xì)胞內(nèi)的繁殖呈特殊的二相發(fā)育周期，分別為有感染性、無(wú)分裂能力的原體(Elementary body，EB)及快速生長(zhǎng)但無(wú)感染性的網(wǎng)狀體(Reticulate body，RB)。RB以二分裂方式增殖后再度分化成EB，EB從細(xì)胞釋放后再次感染新的宿主細(xì)胞，整個(gè)發(fā)育周期約需 48-72 h［2］。在饑餓、抗生素、IFN-γ作用以及抗感染免疫等條件下，Ct在宿主細(xì)胞內(nèi)會(huì)形成非典型感染狀態(tài)，電鏡下表現(xiàn)為既不同于原體也不同于始體的細(xì)胞，被稱為異常RB，為目前公認(rèn)的Ct持續(xù)感染顯微結(jié)構(gòu)［10］。在前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，我們利用IFN-γ建立了Ct L2持續(xù)感染Hela細(xì)胞的模型。光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)持續(xù)感染狀態(tài)下的L2包涵體體積小于急性感染狀態(tài)下的L2包涵體，但更細(xì)微的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)則需要在電鏡下觀察。

TLRs是廣泛存在于固有免疫細(xì)胞上的一類(lèi)模式識(shí)別受體(Pattern-recognition receptors，PRRs)，可識(shí)別多種PAMPs［6］。在病原體入侵的幾分鐘內(nèi)，各種TLRs即可通過(guò)相同或不同的胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑誘導(dǎo)一系列基因活化，致使細(xì)胞分泌炎癥細(xì)胞因子和趨化因子，誘發(fā)炎癥反應(yīng)，產(chǎn)生固有免疫應(yīng)答，并在適應(yīng)性免疫應(yīng)答中起重要的調(diào)節(jié)作用。已有研究證實(shí)，急性感染狀態(tài)下，TLR4信號(hào)途徑可識(shí)別Ct來(lái)源的 cHSP60、LPS 等 PAMPs，誘生 IFN-γ、IL-6、IL-10 等多種炎癥因子，在調(diào)控固有免疫細(xì)胞的活性、控制或消除感染中起重要作用［7，8］。我們研究發(fā)現(xiàn)，隨著Ct感染時(shí)間延長(zhǎng)，Hela細(xì)胞的TLR4轉(zhuǎn)錄水平明顯升高，與Ct急性感染相比較，持續(xù)感染模型中的變化更為顯著，提示Ct持續(xù)感染狀態(tài)下宿主細(xì)胞內(nèi)的TLR4信號(hào)通路受到了調(diào)控，但其具體調(diào)控機(jī)制及作用尚不明確。

現(xiàn)已知TLRs途徑可誘導(dǎo)細(xì)胞因子產(chǎn)生。TLR4單抗可有效阻斷肺炎衣原體HSP10作用的人單核-巨噬樣細(xì)胞 THP-1細(xì)胞分泌 IL-6［11］。還有研究證實(shí)，TLRs信號(hào)與 IL-6間存在負(fù)反饋環(huán)［12］。我們研究發(fā)現(xiàn)，Ct不同感染模式下，Hela細(xì)胞的TLR4轉(zhuǎn)錄水平隨時(shí)間變化趨勢(shì)與IL-6的分泌水平一致，但兩者之間是單純的因果關(guān)系還是存在更為復(fù)雜的負(fù)反饋調(diào)控機(jī)制，還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)分析。

Ct感染的病理特點(diǎn)是炎癥反應(yīng)，隨著反復(fù)持續(xù)感染，炎癥加重，最終導(dǎo)致組織損傷和瘢痕形成。Ct感染的主要靶細(xì)胞是泌尿生殖道上皮細(xì)胞和眼瞼粘膜上皮細(xì)胞，它們可以產(chǎn)生大量炎癥因子，尤其是IL-1、IL-8 和 IL-6 等［7-9］，炎癥因子一方面可以直接介導(dǎo)宿主的固有免疫應(yīng)答，參與宿主抵抗Ct感染的第一道防線;另一方面可以導(dǎo)致組織細(xì)胞的病理?yè)p傷。因此，在感染過(guò)程中Ct與這些炎癥因子的相互作用關(guān)系是疾病進(jìn)展的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，研究這些炎癥因子產(chǎn)生的機(jī)制有助于理解Ct的致病機(jī)制，對(duì)疾病防治也有重要意義。IL-6作為具有最廣泛的生物學(xué)效應(yīng)的細(xì)胞因子之一，同時(shí)具有促炎和抗炎的雙向作用。在內(nèi)皮細(xì)胞中，IFN-γ介導(dǎo)的SOCS3表達(dá)導(dǎo)致了IL-6誘導(dǎo)的STAT3活化受抑，進(jìn)而降低了IL-6依賴的抗炎基因表達(dá)，使得IL-6的生物學(xué)作用由抗炎向促炎發(fā)生轉(zhuǎn)變，參與了內(nèi)皮細(xì)胞炎癥損傷［13，14］。而關(guān)于IL-6在Ct感染中的促炎和抗炎作用目前并無(wú)統(tǒng)一觀點(diǎn)，之前的研究發(fā)現(xiàn)在衣原體的持續(xù)感染狀態(tài)下有持續(xù)的IL-6的分泌［15］，我們的研究也證實(shí)在Ct感染后，尤其是持續(xù)感染狀態(tài)下，宿主細(xì)胞持續(xù)高表達(dá)IL-6，且隨著感染時(shí)間延長(zhǎng)IL-6分泌量增加，提示IL-6的產(chǎn)生可能促進(jìn)了細(xì)菌生長(zhǎng)。但是Ct誘導(dǎo)IL-6的產(chǎn)生機(jī)制以及IL-6在Ct感染中的具體作用還不清楚，在Ct反復(fù)持續(xù)感染宿主過(guò)程中，IL-6是發(fā)揮促炎作用加重炎癥還是發(fā)揮抑炎作用參與免疫調(diào)節(jié)，以及是否有助于Ct逃避免疫清除，目前仍不清楚。

STAT3是信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子(Signal transducer and activator of transcription，STAT)家族的成員之一，IL-6的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)主要依賴于STAT3的參與［16］。IL-6與其膜受體結(jié)合后，激活STAT3，使其二聚化進(jìn)入核內(nèi)啟動(dòng)多種基因轉(zhuǎn)錄活化，啟動(dòng)多種效應(yīng)，包括細(xì)胞增殖反應(yīng)、急性炎癥反應(yīng)以及細(xì)胞凋亡等［17］。本研究發(fā)現(xiàn)在用 IFN-γ建立的 Ct持續(xù)感染的模型中，與Ct急性感染相比，Hela細(xì)胞的STAT3轉(zhuǎn)錄水平顯著升高，且呈現(xiàn)出在感染早期(18 h之內(nèi))急劇升高，18 h后逐漸下調(diào)的變化趨勢(shì);有趣的是，這一變化趨勢(shì)與IL-6的mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)變化并不完全一致，推測(cè)可能是某些目前尚不明確的機(jī)制(如STAT1的拮抗作用)調(diào)控了STAT3的轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后的蛋白活性。但是有關(guān)Ct持續(xù)性感染后的STAT3下游信號(hào)尚不清楚，STAT3信號(hào)參與促炎還是抑炎，介導(dǎo)細(xì)胞損傷還是組織保護(hù)，因此我們的工作初步探索了TLRs可能參與衣原體持續(xù)感染后IL-6/STAT3信號(hào)通路的調(diào)控，更具體的分子機(jī)制還需要我們進(jìn)一步的研究。

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