劉麗娟 寇景軒 田寶振 王海防 程 鵬 崔 勇 公茂慶

(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，山東省寄生蟲病防治研究所，山東濟寧 272033)

球孢白僵菌屬于半知菌亞門Deuteromycotina，白僵菌屬Beauveria，是一種常規(guī)的生物殺蟲劑，具有高效、對非靶標生物較安全、容易大量生產(chǎn)以及防治成本低廉等特點(Genthneretal.，1992；韓寶瑜等，1996；)，而且與部分低毒殺蟲劑具有較好的相容性(Hancock，2009；Howardetal.，2010；蔡悅等，2011；熊琦等，2012)，可以與化學(xué)殺蟲劑混用，共同防治害蟲。球孢白僵菌在農(nóng)、林業(yè)害蟲的防治中已廣泛應(yīng)用(Teferaetal.，2003；Rassetteetal.，2011；鄧春生等，2012)，尤其對玉米螟和松毛蟲的生物防治，在國內(nèi)已作為常規(guī)手段連年使用。目前研究發(fā)現(xiàn)球孢白僵菌對蚊蟲具有致病性，尤其對傳瘧蚊蟲的致病性研究已有較多報道(Achonduhetal.，2008；De Paulaetal.，2008；Mnyoneetal.，2012)，對淡色庫蚊Culexpipienspallens致病性的研究較少。淡色庫蚊屬于尖音庫蚊的亞種，可傳播班氏絲蟲病及流行性腦炎等蚊媒傳染病，是重要的傳播媒介，目前已對多種化學(xué)殺蟲劑產(chǎn)生不同程度的抗藥性(王新國等，2003；Huangetal.，2003)，因此真菌對淡色庫蚊致病性的研究意義重大。受生境微氣候的影響，蚊蟲對真菌殺蟲劑也可能表現(xiàn)出不同程度的敏感性，因此，我們采集5個不同點的淡色庫蚊幼蟲用于試驗，以期初步研究白僵菌對不同生境蚊蟲的致病力，為蚊蟲的生物防治提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1供試菌株：試驗用球孢白僵菌Beauveriabassiana從鱗翅目僵蟲上分離獲得，現(xiàn)保存于山東省寄生蟲病防治研究所。利用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(Potato Dextrose Agar，PDA)斜面4℃保存菌株，試驗時將菌株轉(zhuǎn)接到PDA平板上進行培養(yǎng)，收集孢子待用。

1.1.2供試蟲源：試驗用蚊蟲分為A、B、C、D和E 5組，A組蚊蟲從濟寧市唐口鎮(zhèn)醫(yī)院污水中采集，B組蚊蟲從濟寧市郊區(qū)養(yǎng)豬場廢水溝采集，C組蚊蟲從微山湖稻區(qū)排水溝中采集，D組蚊蟲從山東省寄生蟲病防治研究所院內(nèi)水缸中采集，E組為室內(nèi)飼養(yǎng)蚊蟲。野外采集到的蚊蟲鑒定蚊種和齡期后直接用于試驗。室內(nèi)蚊蟲飼養(yǎng)條件：溫度28℃，相對濕度為70%～80%，光周期為光照:黑暗=12L:12D，幼蟲用豬肝粉和酵母粉的混合飼料喂養(yǎng)。試驗均用淡色庫蚊2齡幼蟲。

1.1.3培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯(去皮)200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水定容至1 000 mL。配置好的培養(yǎng)基經(jīng)高溫高壓滅菌(121℃，30 min)。

1.2 方法

1.2.1孢子懸浮液的配制：試驗時將供試菌株轉(zhuǎn)接到PDA平板上，在25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1周，待菌落長滿PDA平板，用0.03%的吐溫80無菌水洗脫，磁力攪拌器攪拌30 min，后用雙層紗布過濾，血球計數(shù)板測量母液濃度。孢子懸浮液濃度稀釋成1×106孢子/mL，待用。

1.2.2球孢白僵菌對不同棲境淡色庫蚊幼蟲的致病力：試驗容器為一次性透明塑料飲水杯，每杯盛有濃度為1×106孢子/mL的孢子懸浮液100 mL，淡色庫蚊2齡幼蟲25條。將5個點蚊蟲設(shè)成5個處理，另設(shè)不加孢子懸浮液的空白對照，每個處理設(shè)4個重復(fù)，每天加一次飼料。試驗溫度25℃，光周期為光照∶黑暗=12L∶12D。連續(xù)觀察10 d，逐日統(tǒng)計感染死亡蟲數(shù)，計算試驗10 d后淡色庫蚊的累計死亡率。

1.2.3統(tǒng)計分析： 所有試驗數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計分析軟件SAS9.1處理，圖由Excel處理系統(tǒng)完成。

2 結(jié)果

球孢白僵菌對不同生境淡色庫蚊幼蟲均有較好的致病力，幼蟲死亡率與菌株處理時間的關(guān)系見圖1。各組對照組蚊蟲在試驗期內(nèi)未有死亡，試驗期間已羽化為成蚊，因此在圖中未標出。從圖中可以看出，經(jīng)孢子懸浮液處理后，各組淡色庫蚊幼蟲的累計死亡率均隨時間的延長而逐漸增加，室內(nèi)飼養(yǎng)蚊蟲的死亡率曲線較平滑，在試驗的3～6 d幼蟲大量死亡；而野外采集蚊蟲的死亡率曲線不規(guī)整，在試驗開始后的第5～8 d，幼蟲大量死亡。試驗10 d后，各組蚊蟲累計死亡率均達95%以上，存活下來的蚊蟲生長緩慢，生活史明顯延長。經(jīng)孢子懸浮液處理后，五組蚊蟲的致死中時LT50見表1，從表中可以看出，室內(nèi)飼養(yǎng)蚊蟲的致死中時LT50最短，僅3.8 d，野外采集蚊蟲的致死中時在6 d左右，其中從養(yǎng)豬場廢水溝中采集的蚊蟲致死中時最長，為6.4 d。唐口鎮(zhèn)醫(yī)院污水、濟寧郊區(qū)養(yǎng)豬場廢水中采集蚊蟲與其他生境中蚊蟲的致死中時LT50差異顯著，稻區(qū)排水溝、院內(nèi)水缸中蚊蟲與室內(nèi)飼養(yǎng)蚊蟲的致死中時LT50差異顯著，其余各組間差異不顯著(F=67，P=0.001)。

圖1 球孢白僵菌處理后不同棲境淡色庫蚊幼蟲的累計死亡率Fig.1 The accumulated mortality of Cx. pipiens pallens from different habitats by the strain of B. bassianaA：從濟寧市唐口鎮(zhèn)醫(yī)院污水中采集的蚊蟲；B：從濟寧市郊區(qū)養(yǎng)豬場廢水溝中采集的蚊蟲；C：從微山湖稻區(qū)排水溝中采集的蚊蟲；D：從山東省寄生蟲病防治研究所院內(nèi)水缸中采集的蚊蟲；E：室內(nèi)飼養(yǎng)蚊蟲。下同。A: Mosquitoes were collected from sewage at TangKou Town hospital；B: Mosquitoes were collected from Piggery waste water at the outskirts of Jining City；C: Mosquitoes were collected from drainage ditch of paddy field in Weishan Lake；D: Mosquitoes were collected from water vat in Shandong Institute of Parasitic Diseases；E: Mosquitoes were breeding in the laboratory.The same below.

處理組Treatment groupLT-P回歸式LT-P regressionLT50/dRAy=12.352x-25.5336.2 a0.9761By=13.055x-30.46.4 a0.9591Cy=13.339x-28.6675.7 b0.9722Dy=13.121x-21.1675.8 b0.9794Ey=12.248x-1.46673.8 c0.9323

LT50一列中，相同字母在0.05水平上差異不顯著(LSD法).

The same letter on the medium lethal times indicates no significant difference atP=0.05 level (LSD).

3 討論

球孢白僵菌作為生物防治的常規(guī)菌種之一，在農(nóng)、林業(yè)害蟲的防治中發(fā)揮了重要的作用，但其作用效果受多種因素的影響，有研究報道害蟲種類以及不同的接種方式均會影響致病菌的作用效果(蔡守平等，2009；劉麗娟等，2011；Bukharietal.，2010)。蚊蟲的孳生環(huán)境復(fù)雜，水體中的微生物種類多，生境內(nèi)的微生物可能影響白僵菌的作用效果，因此，本文利用從自然界中分離篩選出來的高致病力菌株，研究其對不同生境蚊蟲的致病力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)球孢白僵菌對不同生境蚊蟲均具有較高的致病力，但野外組蚊蟲的致死中時LT50明顯大于室內(nèi)飼養(yǎng)蚊蟲，究其原因，一方面可能因為野外蚊蟲在自然界中遵循優(yōu)勝劣汰的自然法則，存活下來的蚊蟲應(yīng)對不良環(huán)境的能力更強；另一方面野外蚊蟲體內(nèi)可能存在某些微生物，對白僵菌具有一定程度的抑制作用，有報道稱德國小蠊Blattellagermanica腸道菌對白僵菌具有明顯的抑制作用(張凡，2012)，蚊蟲腸道中是否存在抑制白僵菌的微生物還需要進一步的研究。自然界中很難達到要求的孢子懸浮液濃度，孳生水體的鹽度、有機物種類以及水體溫度均會影響真菌的致病性。綜上幾種原因，白僵菌對野外組蚊蟲雖然表現(xiàn)出了較高的致病力，但是在利用白僵菌防治蚊蟲時，其防治效果與實驗室結(jié)果可能存在很大差異，推廣應(yīng)用前還需要進行大量的田間試驗。另外，孳生環(huán)境中微生物對白僵菌致病性的影響也是今后研究的方向。