張 穎 孔令聰 張 靜 趙 權(quán)** 尹繼剛**

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 長(zhǎng)春 130118; 2. 人畜共患病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林大學(xué)人畜共患病研究所，長(zhǎng)春 130062)

隱孢子蟲Cryptosporidiumparvum是一種在醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)學(xué)上危害嚴(yán)重的重要寄生原蟲，該蟲可感染包括人類在內(nèi)的大多數(shù)脊椎動(dòng)物，引起免疫正常個(gè)體的自限性腹瀉，及免疫功能受損患者的漸進(jìn)性、致死性腹瀉。頂復(fù)器原蟲有一個(gè)共同的侵入機(jī)制，是依賴于侵入蟲體頂端特殊的分泌器官(微線、棒狀體和致密顆粒) 分泌的一系列物質(zhì)，以一種獨(dú)特的滑移運(yùn)動(dòng)方式侵入宿主細(xì)胞(Dubremetzetal.，1998)。

Apple結(jié)構(gòu)域?qū)儆赑AN蛋白超家族的一類，該蛋白家族已在纖溶酶原相關(guān)蛋白中發(fā)現(xiàn)，如凝血因子VI，血漿前激肽釋放酶、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子和巨噬細(xì)胞刺激因子，同時(shí)在一些線蟲蛋白也發(fā)現(xiàn)了該結(jié)構(gòu)域。Apple/PAN結(jié)構(gòu)域含有3個(gè)保守的二硫鍵可穩(wěn)定其三級(jí)結(jié)構(gòu)，但在一級(jí)結(jié)構(gòu)水平上的同源性通常較低，這可能與其不同的配體結(jié)合特性相關(guān)。Apple/PAN結(jié)構(gòu)域也存在于一些頂器門原蟲的微線蛋白中，如EtMIC5、TgMIC4 和TRAP-C1(Carruthersetal.，2008)。對(duì)TgMIC4的研究表明，該蛋白質(zhì)通常與TgMIC1和TgMIC6形成復(fù)合體。TgMIC4的前2個(gè)apple 結(jié)構(gòu)域與TgMIC的TSR-like結(jié)構(gòu)域直接作用，如果沒(méi)有TgMIC1,TgMIC4不能與宿主細(xì)胞結(jié)合(Saourosetal.，2005)。近來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)(Kelleretal.，2004)，含有Apple結(jié)構(gòu)域的TgAMA1 蛋白能夠與棒狀體頸部蛋白(RON)形成并維持活動(dòng)連接的結(jié)構(gòu)，參與蟲體的侵入過(guò)程。為了更好地研究隱孢子蟲含有Apple結(jié)構(gòu)域蛋白的功能，本研究利用PCR方法從牛微小隱孢子蟲子孢子cDNA文庫(kù)中克隆得到cgd3-520序列中的Apple結(jié)構(gòu)域基因，并對(duì)其進(jìn)行原核表達(dá)，以純化的GST-Apple重組蛋白為免疫原，制備了高特異性的抗重組Apple單克隆抗體，為進(jìn)一步研究Apple結(jié)構(gòu)域類蛋白功能，及探索隱孢子蟲黏附侵入機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

大腸埃希菌DH5α、BL21、原核表達(dá)載體pGEX-4T-1為本實(shí)驗(yàn)室傳代保種；微小隱孢子蟲cDNA文庫(kù)為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建；骨髓瘤細(xì)胞購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)；Balb/c小鼠購(gòu)自吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；Ex Taq DNA聚合酶、DNA Marker、BamHI、XhoI和T4 DNA連接酶、IPTG購(gòu)自大連寶生物公司(TaKaRa)；堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體、顯色劑BCIP/NBT、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑為Sigma公司產(chǎn)品；HT培養(yǎng)基、HAT選擇培養(yǎng)基、胎牛血清、1640培養(yǎng)液為HyClone公司產(chǎn)品；凝膠片段回收純化試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自Axygen公司；鼠單克隆抗體亞類檢測(cè)試劑盒為Sigma產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1微小隱孢子蟲Apple結(jié)構(gòu)域基因的體外擴(kuò)增：根據(jù)微小隱孢子蟲基因庫(kù)中cgd3-520序列中的編碼Apple結(jié)構(gòu)域基因加上相應(yīng)酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)并合成引物： Apple：上游(5′-GGATCCGGATCATCATTTACAGGA-3′)下游：(5′-CTCGAGTCATGGACAAGAAACTGACC-3′)，下劃線部分為酶切位點(diǎn)。以本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的微小隱孢子蟲cDNA文庫(kù)為模板，PCR擴(kuò)增目的基因。

1.2.2微小隱孢子蟲Apple結(jié)構(gòu)域基因的克?。簩U(kuò)增的Apple結(jié)構(gòu)域基因純化的PCR產(chǎn)物與克隆載體pMD18-T于16℃連接12 h，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸埃希菌DH5α中。從LB平板上挑取單個(gè)菌落，將其接種在含有氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)過(guò)夜，用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、XhoⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定，將陽(yáng)性克隆命名為pMD18-T-Apple，送至上海生工測(cè)序鑒定。

1.2.3質(zhì)粒pGEX-4T-1與Apple 基因的連接及重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化：將pMD18-T-Apple質(zhì)粒和pGEX-4T-1質(zhì)粒分別用BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切后進(jìn)行凝膠電泳。膠回收試劑盒回收Apple結(jié)構(gòu)域基因的目的片段與表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-1，并用T4 DNA連接酶16℃連接12 h。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌BL21感受態(tài)中，涂板后提取質(zhì)粒并酶切鑒定。陽(yáng)性質(zhì)粒送至上海生工測(cè)序鑒定。將陽(yáng)性重組質(zhì)粒命名為pGEX-4T-1-Apple。

1.2.4GST-Apple重組蛋白的表達(dá)及純化：陽(yáng)性重組菌1%接入200 mL含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)至菌液OD值達(dá)到0.6，液體中加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)4 h，12%SDS-PAGE分析。應(yīng)用Gluthathione-Sepharose 4B親和純化GST融合蛋白。整個(gè)純化過(guò)程在低溫下進(jìn)行，以減緩重組蛋白的降解速度。純化結(jié)果用12%SDS-PAGE分析，并用抗GST抗體對(duì)重組蛋白進(jìn)行Western-blot分析，將純化后的重組蛋白命名為GST-Apple。

1.2.5動(dòng)物免疫：選擇8周齡Balb/c雌性小鼠，以純化的GST-Apple作為免疫原，首免用20 μg與等體積弗氏完全佐劑乳化，腹腔免疫；在首免后第14、28 d，用20 μg與弗氏不完全佐劑乳化，腹腔免疫。在第42 d尾尖采血，分離血清并用間接ELISA方法檢測(cè)效價(jià)。

1.2.6細(xì)胞融合：融合前3 d用20 μg免疫原溶液不加佐劑尾部靜脈注射加強(qiáng)免疫。按常規(guī)方法進(jìn)行融合(Kohler，1976)。將SP2/0細(xì)胞與免疫脾細(xì)胞按1∶10比例混合，在50%聚乙二醇(PEG 1500)作用下融合， 用HAT培養(yǎng)液懸浮，滴入96孔板，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第10 d后改用HT培養(yǎng)液，第20 d后改用20%1640完全培養(yǎng)液。

1.2.7單克隆抗體的的篩選及亞克?。撼Ｒ?guī)融合后10～12 d，待細(xì)胞集落長(zhǎng)至1/4培養(yǎng)孔大小時(shí)，用已建立的ELISA技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)、篩選。陽(yáng)性克隆孔采用有限稀釋法進(jìn)行3次亞克隆，陽(yáng)性率約達(dá)到100%時(shí)可擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.2.8誘生腹水：在預(yù)先1周注射石蠟油致敏的Balb/c小鼠腹腔接種已建立的雜交瘤細(xì)胞約1×106個(gè)，待1周后腹腔膨大，采取腹水并3 500 r/min離心10 min，去除沉淀，取上清，分裝后凍存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.9Ig亞型與亞類鑒定：用陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株培養(yǎng)上清，參照Ig亞類與亞型試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.2.10單克隆抗體的Western-blot分析：將純化的重組蛋白GST-Apple進(jìn)行SDS-PAGE后，半干法轉(zhuǎn)印至NC膜上，10%脫脂牛奶37℃封閉 1 h，分別加入2H6株和5F11株雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清作為一抗，于37℃孵育1 h，PBST洗滌4次；加入AP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG作為二抗，于37℃孵育1 h，PBST洗滌4次，加入BCIP/NBT顯色。

1.2.11間接ELISA法測(cè)定抗體效價(jià)：以免疫GST-Apple小鼠血清為陽(yáng)性對(duì)照，未免疫小鼠血清為陰性對(duì)照，PBS為空白對(duì)照。重組GST-Apple蛋白以10 μg/mL包被ELISA板，將兩株單抗按1∶4 000、1∶8 000倍比稀釋至1∶8.192×106，二抗為1∶2 000稀釋的羊抗小鼠IgG，PNPP顯色后用酶標(biāo)儀讀取數(shù)值。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒的PCR、酶切鑒定和測(cè)序

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳觀察， Apple基因在100～250 bp之間有一條帶，與目的基因210 bp大小相符(圖1)。

圖1 微小隱孢子蟲含Apple結(jié)構(gòu)域基因的PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of Apple gene of Cryptosporidium parvumM: DL2000 DNA marker；1～2: Apple基因PCR產(chǎn)物.M: DL2000 DNA marker；1-2: PCR amplification of Apple gene.

pGEX-4T-1-Apple重組表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切驗(yàn)證，1%瓊脂糖凝膠電泳觀察酶切產(chǎn)物，在100～250 bp之間及5 000 bp附近可見(jiàn)條帶(圖2)。經(jīng)酶切鑒定的陽(yáng)性克隆菌，送至上海生工生物公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用DNAMAN與cDNA文庫(kù)中的Apple基因序列對(duì)比，堿基序列完全正確。

圖2 重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-Apple酶切驗(yàn)證Fig.2 Identification of recombinant pGEX-4T-1-Apple by enzyme digestionM: DL2000 DNA marker；1～2: BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切pGEX-4T-1-Apple.M: DL2000 DNA marker; 1-2: pGEX-4T-1-Apple digested by BamHⅠ+ XhoⅠ.

2.2 GST-Apple重組蛋白的表達(dá)與純化

經(jīng)表達(dá)條件摸索分析，GST-Apple重組蛋白在25℃，0.1 mmol/L條件下呈可溶性高效表達(dá)，將誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體裂解液上清用Gluthathione-Sepharose 4B純化，并用SDS-PAGE和Western-blot分析，得到較純的目的條帶，重組蛋白大小約為34 kDa(圖3～4)。

圖3 純化后的重組蛋白GST-Apple的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of purified recombinant GST-AppleM: 低分子量蛋白marker; 1～2: 純化后的GST-Apple蛋白; 3: 純化后的GST載體蛋白.M: Protein mid-molecular weight marker;1-2: The purified product of recombinant GST-Apple; 3: The purified GST protein.

圖4 GST-Apple重組蛋白的Western-blot分析Fig.4 Western-blot of recombinant GST-Apple proteinsM:預(yù)染marker; 1～2:純化后的GST-Apple蛋白; 3: 純化后的GST載體蛋白.M: Prestained protein Marker; 1-2: The purified product of recombinant GST-Apple; 3: The purified GST protein.

2.3 免疫小鼠的效價(jià)測(cè)定

常規(guī)間接ELISA方法分別測(cè)定3只Balb/c小鼠的血清效價(jià)，血清稀釋倍數(shù)為100、200、400、800、1 600、3 200、6 400、12 800、25 600、51 200，結(jié)果證明3只小鼠血清51 200倍稀釋均為陽(yáng)性，適宜融合。

2.4 雜交瘤細(xì)胞株的建立

本實(shí)驗(yàn)融合2次，鋪6塊96孔板進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，融合7天后觀察其融合率為51%。用純化的GST-Apple重組蛋白和GST載體蛋白進(jìn)行篩選，其中15個(gè)孔為陽(yáng)性，經(jīng)3次亞克隆篩選，得到2株分泌抗體僅與GST-Apple重組蛋白反應(yīng)而與GST蛋白不發(fā)生反應(yīng)的雜交瘤細(xì)胞株，命名為2H6和5F11。挑取單個(gè)克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，每傳2代檢測(cè)1次效價(jià)，至20代以上仍然呈穩(wěn)定陽(yáng)性，擴(kuò)大培養(yǎng)后液氮凍存，經(jīng)復(fù)蘇后對(duì)細(xì)胞上清進(jìn)行檢測(cè)仍保持抗體分泌能力。

2.5 抗體類型及亞型

檢測(cè)得知2株雜交瘤細(xì)胞分泌的重鏈均為IgG1，輕鏈均為κ。

2.6 單克隆抗體的特異性鑒定

Western-blot結(jié)果顯示2株單抗均能與GST-Apple重組蛋白發(fā)生特異性結(jié)合，與GST載體蛋白無(wú)反應(yīng)(圖5)，表明這兩株單抗能夠特異性識(shí)別重組Apple結(jié)構(gòu)域蛋白。

圖5 單克隆抗體識(shí)別重組蛋白GST-Apple的Western-blot 分析Fig.5 Western-blot analysis of McAbs VS recombinant Apple proteinsM:預(yù)染marker；1: 2H6株細(xì)胞上清與GST蛋白；2: 5F11株細(xì)胞上清與 GST蛋白；3: 2H6株細(xì)胞上清與 GST-Apple重組蛋白；4: 5F11株細(xì)胞上清與 GST-Apple重組蛋白.M. Prestain marker;1: 2H6 culture supernatant with GST protein; 2: 5F11 culture supernatant with GST protein; 3: 2H6 culture supernatant with recombinant GST-Apple protein; 4: 5F11 culture supernatant with recombinant GST-Apple protein.

2.7 抗體效價(jià)

2H6、5F11兩株單抗稀釋后均能與重組蛋白GST-Apple發(fā)生特異性反應(yīng)，且2H6腹水效價(jià)可達(dá)1∶1.024×106倍、5F11腹水效價(jià)可達(dá)1∶2.048×106倍。

3 討論

原蟲和宿主細(xì)胞間相互作用是近幾年國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一。隱孢子蟲子孢子表膜配體與宿主上皮細(xì)胞表面受體的識(shí)別黏附是蟲體侵入的關(guān)鍵(Sandersonetal., 2008)。很多含Apple結(jié)構(gòu)域蛋白廣泛存在于頂復(fù)器原蟲，如弓形蟲MIC4(Beghettoetal., 2005; 李學(xué)瑞等, 2007)、艾美耳球蟲MIC5(Perizetal., 2007)和肉孢子蟲的SML-2蛋白(Mulleretal., 2011)。弓形蟲的MIC4含有6個(gè)Apple結(jié)構(gòu)域，每個(gè)Apple結(jié)構(gòu)域包含6個(gè)保守的半胱氨酸殘基，已證實(shí)其C末端的6個(gè)Apple結(jié)構(gòu)域?yàn)橹饕酿じ絽^(qū)域，其中第5個(gè)Apple結(jié)構(gòu)域具有半乳糖結(jié)合活性(Marchantetal., 2012)。Brown等(2000)克隆了艾美耳球蟲的MIC5基因，該基因全長(zhǎng)3 334 bp，編碼1個(gè)分子量約為105 kDa的蛋白質(zhì)。序列分析表明，MIC5在結(jié)構(gòu)上含有11個(gè)半胱氨酸序列，組成4個(gè)Apple結(jié)構(gòu)域，其Apple結(jié)構(gòu)域與血栓凝聚因子X(jué)I和血漿前激肽釋放酶等結(jié)構(gòu)相似，都與細(xì)胞黏附相關(guān)。結(jié)構(gòu)域分析提示，MIC5可能在子孢子附著和侵入宿主細(xì)胞過(guò)程中介導(dǎo)蛋白與受體的相互作用，從而促進(jìn)子孢子的侵入。最新的研究發(fā)現(xiàn)，弓形蟲PL104蛋白質(zhì)含有11個(gè)Apple/PAN結(jié)構(gòu)域，可介導(dǎo)與宿主細(xì)胞的黏附(Gongetal., 2012)。肉孢子蟲的微線體蛋白SML-2屬于半乳糖外源凝集素類，通過(guò)Apple結(jié)構(gòu)域形成二聚體形式，Apple結(jié)構(gòu)域的末端還有半乳糖支架結(jié)構(gòu)，是SML-2蛋白的高度特異性結(jié)合位點(diǎn)(Mulleretal., 2011)，其半乳糖結(jié)合位點(diǎn)與弓形蟲的MIC4蛋白的半乳糖結(jié)合位點(diǎn)高度相似，并且Apple結(jié)構(gòu)域所特有的高度疏水特性和內(nèi)部的24個(gè)氫鍵可以穩(wěn)定二聚體結(jié)構(gòu)，以此來(lái)增強(qiáng)寄生蟲表面蛋白對(duì)水解作用的抵抗性，保證蟲體在終末宿主腸道中的存活。

與已報(bào)道的制備抗隱孢子蟲單克隆抗體方法相比，本實(shí)驗(yàn)采用原核表達(dá)并純化的可溶性Apple結(jié)構(gòu)域蛋白代替天然蛋白作為免疫原，這樣可以減少了陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株篩選的工作量，而且更容易獲得特異性的單克隆抗體(吳錦雅等, 2005)。在雜交瘤細(xì)胞的篩選過(guò)程中，本實(shí)驗(yàn)采用Apple結(jié)構(gòu)域重組蛋白篩選出陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株后，還用GST載體蛋白對(duì)陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行負(fù)篩選，以排除假陽(yáng)性，保證制備的單克隆抗體為針對(duì)Apple結(jié)構(gòu)域蛋白表位，從而得到免疫反應(yīng)親和力強(qiáng)，特異性好的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株。為定位微小隱孢子蟲含Apple結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)和其功能的研究奠定了基礎(chǔ)。