李 昊，許德嬌，岑華蕊，程 娟，王烈成

右美托咪定(dexmedetomidine，Dex)作為一種高選擇性的α2腎上腺素受體激動劑，它可產(chǎn)生與正常睡眠相似、可喚醒的效果，具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗焦慮和應(yīng)激保護作用[1]。Dex可使機體體溫和血壓在安全范圍內(nèi)有一定的下降；Dex通過激活藍斑(locus coeruleus，LC)的下行抑制系統(tǒng)發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用，由脊髓α2受體介導(dǎo)[2]；具有神經(jīng)保護作用[3]，在抵抗應(yīng)激、炎癥和腦損傷中具有器官保護作用[4]。目前該藥物已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于臨床。催產(chǎn)素(oxytocin，OXT)是一種神經(jīng)肽，具有多種功能，包括收縮子宮，尤其以妊娠子宮更加敏感；在哺乳期可以促進分泌乳汁；具有神經(jīng)保護作用，在抗焦慮、降低炎癥反應(yīng)、學(xué)習(xí)和記憶中發(fā)揮作用[5]。Dex是否可以作用在OXT神經(jīng)元，尚未見報道。該實驗研究Dex對丘腦室旁核(paraventricular nucleus of hypothalamus，PVN)、丘腦室上核(supraoptic nucleus，SON)腦區(qū)的c-Fos陽性神經(jīng)元細胞和OXT神經(jīng)元共標(biāo)記情況，進一步探究Dex是否會增強OXT釋放進而增強神經(jīng)保護和抗炎作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗動物 成年SPF小鼠(C57BL/6J)，年齡8～10周(體質(zhì)量21～26 g)，采購于浙江維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。小鼠可自由獲得標(biāo)準(zhǔn)飼料和無菌水，在室溫(26±1) ℃，濕度40%～70%，光/暗循環(huán)12 h/12 h(從08：00—20：00開燈)。符合安徽醫(yī)科大學(xué)動物倫理委員會要求(倫理號：20190235)，并在實驗中努力減少小鼠的數(shù)量及減輕它們所經(jīng)歷的任何疼痛或者不適。

1.1.2藥品與試劑 右旋美托咪定注射液購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司；兔源一抗c-Fos抗體、鼠源一抗c-Fos抗體購自美國Abcam公司；兔源一抗AVP抗體、兔源一抗OXT抗體購自美國ImmunoSta公司；羊抗兔和羊抗鼠二抗均購自美國Alexa Fluor分子探針公司；山羊血清封閉液、Fluoromount水性封片劑購自德國Sigma-aldrich公司。曲拉通X-100 購自上海昂一生物公司。

1.1.3實驗儀器 灌流蠕動泵(河北齊力恒流泵有限公司)；冷凍切片機(德國徠卡公司)；小鼠腦槽儀(深圳瑞沃德公司)；熒光倒置顯微鏡、玻片掃描儀(日本奧林巴斯公司)；共聚焦顯微鏡(德國蔡司公司)。

1.2 方法

1.2.1實驗動物分組及給藥方式 取8～10周C57小鼠18只，隨機分為Saline組和Dex組，給藥方式為腹腔注射(ip)，每只小鼠注射劑量為：0.1 ml/10 g。其中，Saline組給予生理鹽水，Dex組給予Dex(100 μg/kg)。

1.2.2小鼠完整大腦取材 小鼠在下午15：00給藥前使用0.04 %異氟烷吸入麻醉后，迅速進行腹腔注射。然后將小鼠在籠中放置120 min后，使用戊巴比妥鈉(80 mg/kg)將小鼠麻醉，再依次用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)、4%多聚甲醛(PFA)通過心臟灌流對大腦固定，剝離顱骨取腦后放入蔗糖溶液脫水3 d。

1.2.3小鼠大腦全腦冰凍切片 首先將脫水完整的大腦放在腦槽儀下沿冠狀面均切成兩部分，切后光滑面作為底座，使用OCT包埋劑包埋后放在冰凍切片機的冰座臺上。冷凍完成后進行全腦厚度40 μm一層的切片，按順序放入含有0.01 mol/L PBS溶液的24孔板中。

1.2.4免疫熒光

1.2.4.1c-Fos免疫熒光染色 取出腦片放入孔板中，用PBS漂洗腦片3次(每次10 min)，5%山羊血清在PBST(0.05% Triton X-100)放入37 ℃水浴鍋封閉1 h，加入相應(yīng)兔來源的c-Fos單一抗體(1 ∶4 000)于4 ℃孵育過夜。PBS漂洗3次，加入相應(yīng)兔源綠色熒光二抗室溫避光孵育2 h。PBS漂洗3次，細胞核用DAPI(1 ∶2 000)孵育20 min。PBS漂洗1次。

1.2.4.2c-Fos和OXT神經(jīng)元免疫熒光共染色 挑選、漂洗、封閉腦片同1.2.4.1加入鼠來源的c-Fos單一抗體(1 ∶1 000)和兔來源的OXT神經(jīng)元抗體(1 ∶2 000),于4 ℃孵育過夜。PBS漂洗3次，加入相應(yīng)兔源紅色熒光和鼠源綠色熒光二抗室溫避光孵育2 h。PBS漂洗3次。

1.2.5免疫熒光成像后陽性細胞計數(shù)方法 本課題中免疫熒光分為兩部分。第一部分大腦腦區(qū)的c-Fos細胞表達是利用奧林巴斯玻片掃描儀顯微成像。第二部分特定腦區(qū)的c-Fos細胞和OXT神經(jīng)元共標(biāo)記是利用蔡司共聚焦顯微成像。對于玻片掃描儀顯微成像后的腦片利用Image J軟件通道拆分和劃定的腦區(qū)自動計數(shù)，為保證計數(shù)精確，再人工對每個自動計數(shù)的陽性細胞數(shù)進行校準(zhǔn)。對于蔡司共聚焦顯微成像的腦片，使用蔡司成像軟件來觀測各層細胞數(shù)量。切片厚度40 μm，采用10 μm一層進行層掃，每張腦片成像約有4～6幅。根據(jù)細胞前后成像的變化，判斷c-Fos細胞和OXT神經(jīng)元是否在同一層，若是，則可判斷為共標(biāo)記細胞。

2 結(jié)果

2.1 Dex對睡眠腦區(qū)腹外側(cè)視前區(qū)(ventrolateral preoptic nucleus， VLPO)和運動皮質(zhì)的c-Fos細胞影響免疫熒光實驗結(jié)果顯示：與Saline組相比，Dex組M1/M2區(qū)域的c-Fos細胞表達降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=9.64，P<0.001)(圖1 A、B、E)；與Saline組相比，Dex組促睡眠腦區(qū)VLPO中c-Fos細胞表達升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-5.15，P<0.05)(圖1 C、D、F)。

圖1 運動皮質(zhì)M1/M2和促睡眠腦區(qū)VLPO的免疫熒光代表圖(n=5)A：Saline組M1/M2腦區(qū)免疫熒光代表圖；B：Dex組M1/M2腦區(qū)免疫熒光代表圖；C：Saline組VLPO腦區(qū)免疫熒光代表圖；D：Dex組VLPO腦區(qū)免疫熒光代表圖；E：M1/M2腦區(qū)c-Fos陽性細胞數(shù)量統(tǒng)計圖；F：VLPO腦區(qū)c-Fos陽性細胞數(shù)量統(tǒng)計圖；1：×10；2：×20；3：×5；與Saline組比較：*P<0.05，***P<0.001

2.2 Dex對促覺醒相關(guān)腦區(qū)的c-Fos細胞表達的影響免疫熒光實驗結(jié)果顯示：與Saline組相比，Dex組LC腦區(qū)中c-Fos的表達降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.45，P<0.01)(圖2 A、B、K)；與Saline組相比，Dex組外側(cè)下丘腦(lateral hypothalamic area， LH)中c-Fos細胞表達降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=7.40，P<0.001)(圖2 C、D、L)；與Saline組相比，Dex組腹側(cè)結(jié)節(jié)乳頭體核(ventral tuberomammillary nucleus, TMN)腦區(qū)c-Fos細胞表達降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.00，P<0.01)(圖2 E、F、M)；與Saline組相比，Dex組背外側(cè)背蓋核(laterodorsal tegmental nucleus， LDT)，臂旁核(parabigeminal nucleus， PB)兩個腦區(qū)c-Fos細胞表達降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(tPB=9.17，tLDT=6.44，P<0.01)(圖2 G～J、N、O)。

圖2 促覺醒相關(guān)腦區(qū)的免疫熒光c-Fos代表圖(n=5)A：Saline組LC腦區(qū)免疫熒光代表圖；B：Dex組LC腦區(qū)免疫熒光代表圖；1：×10；2：×20；C：Saline組LH腦區(qū)免疫熒光代表圖；D：Dex組LH腦區(qū)免疫熒光代表圖；1：×5；2：×10；E：Saline組TMN腦區(qū)免疫熒光代表圖；F：Dex組TMN腦區(qū)免疫熒光代表圖；1：×5；2：×10；G：Saline組LDT腦區(qū)免疫熒光代表圖；H：Dex組LDT腦區(qū)免疫熒光代表圖；1：×5；2：×20；I：Saline組PB腦區(qū)免疫熒光代表圖；J：Dex組PB腦區(qū)免疫熒光代表圖；1：×5；2：×10；K～O：LC、LH、TMN、LDT、PB腦區(qū)c-Fos細胞數(shù)量統(tǒng)計圖；與Saline組比較：**P<0.01，***P<0.001

2.3 Dex對大腦感覺神經(jīng)核SFO、AP、SOL的c-Fos細胞表達影響免疫熒光實驗結(jié)果顯示：與Saline組相比，Dex組的小鼠穹窿下器(subfornical organ， SFO)腦區(qū)c-Fos細胞表達增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-5.22，P<0.01)(圖3 A、B、E)；與Saline組相比，Dex組延髓最后區(qū)(area postrema， AP)和孤束核(solitary tract， SOL)腦區(qū)的c-Fos細胞表達增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(tAP=-12.15，tSOL=-7.05，P<0.001)(圖3 C、D、F、G)。

圖3 Dex對機體感覺神經(jīng)核SFO、AP、SOL的影響(n=5)A：Saline組SFO腦區(qū)免疫熒光代表圖；B：Dex組SFO腦區(qū)免疫熒光代表圖；1：×5；2：×10；C：Saline組AP、SOL腦區(qū)免疫熒光代表圖；D：Dex組AP、SOL腦區(qū)免疫熒光代表圖；0：AP、SOL腦區(qū) ×5；1：AP腦區(qū) ×20；2：SOL腦區(qū) ×10；E～G：SFO、AP、SOL腦區(qū)c-Fos細胞數(shù)量統(tǒng)計圖；與Saline組比較：**P<0.01，***P<0.001

2.4 Dex對PVN、SON、SCN腦區(qū)的c-Fos細胞表達的影響免疫熒光實驗結(jié)果顯示：與Saline組相比，Dex組SON腦區(qū)c-Fos細胞表達增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-3.73，P<0.05)(圖4 A、B、G)；Dex組PVN和視交叉上核(suprachiasmatic nucleus， SCN)腦區(qū)c-Fos細胞表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖4 C～F、H、I)。

圖4 SON、PVN、SCN腦區(qū)免疫熒光c-Fos表達代表圖(n=5)A：Saline組SON腦區(qū)免疫熒光代表圖；B：Dex組SON腦區(qū)免疫熒光代表圖；1：×10；2：×20；C：Saline組PVN腦區(qū)免疫熒光代表圖 ×10；D：Dex組PVN腦區(qū)免疫熒光代表圖 ×10；E：Saline組SCN腦區(qū)免疫熒光代表圖 ×10；F：Dex組SCN腦區(qū)免疫熒光代表圖 ×10；G～I：SON、PVN、SCN腦區(qū)c-Fos細胞數(shù)量統(tǒng)計圖；與Saline組比較：*P<0.05

2.5 Dex對PVN、SON中OXT神經(jīng)元和c-Fos細胞共標(biāo)記的影響本實驗中，小鼠腹腔注射給藥后進行免疫熒光c-Fos細胞和OXT神經(jīng)元共成像。顯微成像后，統(tǒng)計了共標(biāo)記神經(jīng)元數(shù)量占總的OXT神經(jīng)元和總的c-Fos細胞的比例。本研究選擇年齡相仿的小鼠，OXT神經(jīng)元在個體間差別不大，圖5 F餅圖顯示的是Dex組和Saline組對應(yīng)的腦區(qū)總OXT神經(jīng)元數(shù)量是基本一致。染色和統(tǒng)計質(zhì)量無誤后，進行共標(biāo)記統(tǒng)計，結(jié)果顯示，與Saline組相比，Dex組PVN、SON腦區(qū)共標(biāo)記神經(jīng)元細胞數(shù)占總OXT神經(jīng)元數(shù)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖5A～E)。

統(tǒng)計共標(biāo)神經(jīng)元細胞數(shù)占該腦區(qū)總的c-Fos細胞的比例，結(jié)果顯示：與Saline組相比，Dex組在PVN腦區(qū)差異無統(tǒng)計學(xué)意義；Dex組在SON腦區(qū)比例下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-3.73，P<0.05)(圖5 G)。

圖5 Saline組及Dex組PVN、SON腦區(qū)免疫熒光共標(biāo)記代表圖(n=4) ×20A：Saline組PVN腦區(qū)免疫熒光共標(biāo)記代表圖；B：Dex組PVN腦區(qū)免疫熒光共標(biāo)記代表圖；C：Saline組SON腦區(qū)免疫熒光共標(biāo)記代表圖；D：Dex組SON腦區(qū)免疫熒光共標(biāo)記代表圖；E：c-Fos細胞和OXT神經(jīng)元共標(biāo)記數(shù)與OXT神經(jīng)元的比例；F：PVN、SON腦區(qū)總OXT神經(jīng)元數(shù)量及共標(biāo)記神經(jīng)元數(shù)占總OXT神經(jīng)元比例；G：c-Fos細胞和OXT神經(jīng)元共標(biāo)數(shù)與c-Fos細胞數(shù)量的比例；1：紅色熒光標(biāo)記的OXT神經(jīng)元；2：綠色熒光標(biāo)記的c-FOS細胞；3：共標(biāo)記圖；箭頭：指示共標(biāo)記的細胞的位置；與Saline組比較：*P<0.05

3 討論

結(jié)果顯示：Dex對促睡眠相關(guān)腦區(qū)細胞表達顯著激活，如VLPO腦區(qū)；而對促覺醒與運動等相關(guān)腦區(qū)細胞表達顯著抑制，如LC、LH、TMN、LDT、PB、M1/M2等腦區(qū)。

作為一種麻醉劑，Dex不可避免地會導(dǎo)致運動功能下降，本課題中，運動皮質(zhì)M1/M2的c-Fos細胞表達顯著降低。VLPO是位于下丘腦外側(cè)與睡眠密切相關(guān)的促睡眠腦區(qū)，在整個睡眠過程中，VLPO表現(xiàn)非?；钴S，c-Fos細胞表達顯著增高[6]。LC是經(jīng)典的促覺醒的核團，其內(nèi)含有豐富的去甲腎上腺素合成神經(jīng)元，這些神經(jīng)元在整個中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)出彌散投射，LC-去甲腎上腺素系統(tǒng)在喚醒、應(yīng)激反應(yīng)中起主要作用[7]。LH是前腦的重要組成部分，是覺醒、防御和新陳代謝的重要控制器，包括食欲素神經(jīng)元、黑色素濃縮激素神經(jīng)元、γ-氨基丁酸能神經(jīng)元，食欲素神經(jīng)元被鑒定為促覺醒神經(jīng)元[8]，免疫熒光顯示Dex可以顯著抑制其活性。LDT在引發(fā)和維持REM睡眠中起重要作用[9]，其主要含有膽堿能和非膽堿能神經(jīng)元。免疫組化實驗證實，LDT在快速眼動睡眠剝奪后的反彈期間膽堿能和非膽堿能神經(jīng)元與Fos細胞共標(biāo)記數(shù)量顯著增多[9]。本課題免疫熒光實驗顯示，Dex降低LDT區(qū)域c-Fos細胞的數(shù)量，這與Dex減少REM睡眠的結(jié)果相一致。有文獻表明，Dex可以在整個睡眠周期中會提高非快速眼動睡眠的比例[10]。此外，LDT中一半以上的膽堿能神經(jīng)元表達有α2受體，提示Dex可能通過LDT的α2受體抑制神經(jīng)元活性，從而減少REM睡眠。然而，Dex是否直接抑制LDT神經(jīng)元，需要電生理膜片鉗技術(shù)進一步驗證。PB位于腦橋灰質(zhì)的重要促覺醒核團之一，免疫熒光結(jié)果顯示，Dex可減少PB的c-Fos細胞表達，提示Dex誘導(dǎo)的鎮(zhèn)靜催眠作用可通過抑制PB神經(jīng)元興奮來介導(dǎo)。SOL是延髓背側(cè)的一個主要感覺核，接收心血管、內(nèi)臟、呼吸、味覺和觸覺的信息[11]。SFO位于第三腦室，在心血管調(diào)節(jié)，能量平衡，免疫反應(yīng)和水礦物質(zhì)平衡方面發(fā)揮作用。SFO缺乏血腦屏障，可以直接感受腦脊液中水礦物質(zhì)的變化，尤其對Na+水平更加敏感，控制水和鹽的攝入[12]。如果被激活可能代表機體水鹽失衡，會主動尋求飲水。Dex的使用可以降低血壓，當(dāng)機體血壓下降時，血管緊張素Ⅱ發(fā)揮升壓作用，其中已被證實SFO與AngⅡ作用致升壓效應(yīng)有關(guān)系[13]。

PVN和SON腦區(qū)存在大量AVP、OXT神經(jīng)元，負責(zé)產(chǎn)生和調(diào)控此類激素的釋放。本研究結(jié)果顯示Dex組PVN、SON腦區(qū)c-Fos細胞和OXT神經(jīng)元共標(biāo)記數(shù)與OXT神經(jīng)元比例無差異性，但共標(biāo)記數(shù)與c-Fos細胞數(shù)量比例降低。結(jié)果分析是Dex組SON腦區(qū)的c-Fos細胞表達數(shù)量較Saline組增高，Saline組激活的多數(shù)c-Fos細胞和OXT神經(jīng)元進行共標(biāo)記，但Dex組增加的c-Fos細胞并未和OXT神經(jīng)元更多地進行共標(biāo)記，這一結(jié)果表明，Dex可能并不會對小鼠機體的OXT神經(jīng)元產(chǎn)生影響，但增加的c-Fos細胞和哪類神經(jīng)元進行共標(biāo)記，還需進一步研究。