吳瑞珊， 蘇運欽， 余廣超， 林曉丹， 李 莉， 陳文璟， 溫旺榮

微小RNA(microRNA，miRNA)是一類廣泛存在于真核生物的長約22個核苷酸的非編碼RNA分子。miRNA具有調(diào)節(jié)生長發(fā)育、脂肪代謝、細胞增殖與凋亡及影響腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲等作用，對炎癥與腫瘤之間的轉(zhuǎn)變起一定的調(diào)節(jié)作用［1］，現(xiàn)已在人類發(fā)現(xiàn)923個miRNA，記錄于miRNA數(shù)據(jù)庫(http://microrna.sanger.ac.uk)［2］。近年研究發(fā)現(xiàn) miRNA廣泛存在于哺乳類動物血清中，自從2008年Lawrie等［3］首先在彌漫性大B細胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL)病人血清中檢測出miR-21升高后，大量研究證明血清miRNA可作為腫瘤及其它疾病診斷、治療及預(yù)后監(jiān)測的無創(chuàng)性生物指標。miR-122位于人類18號染色體18q21.31上，是一種肝臟特異性miRNA，影響肝臟的生理與病理過程［4］。我國是乙型肝炎的高發(fā)區(qū)，也有丙型肝炎的報道，這兩種肝炎的慢性化和纖維化后可發(fā)展為肝癌。目前肝癌病死率在我國惡性腫瘤位居第3位，嚴重威脅人類健康。現(xiàn)在這些肝臟疾病的相關(guān)標志物有相關(guān)病毒的抗原、抗體、核酸及甲胎蛋白(alpha fetal protein，AFP)等。AFP對肝癌檢測特異性高，但敏感性不夠，往往AFP高時已是肝癌晚期，無法早期診斷。為了從miRNA中尋找能特異、敏感的肝癌標志物，我們利用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)檢測了不同肝臟疾病血清中miR-122表達水平，考察miR-122與肝臟不同疾病標志物的關(guān)系，試圖研究miR-122能否作為肝癌疾病的新指標。

材料和方法

1 標本

選取2011年9月～2012年4月暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院住院和門診病人及健康體檢者共93例作為研究對象，見表1。其中以健康體檢者15例為正常對照(healthy control，HC)組;經(jīng)過肝臟影像學(xué)、病理學(xué)及標志物檢測，肝癌指標陰性但血清HBV-DNA含量＞1×105U/L及HBsAg陽性的患者15例為乙型肝炎(hepatitis B)組;經(jīng)過肝臟影像學(xué)、病理學(xué)及標志物檢測，肝癌指標陰性但血清HCV-RNA含量＞1×106U/L及抗HCV陽性的患者15例為丙型肝炎(hepatitis C)組;以病理結(jié)果為肝細胞癌的患者27例為肝癌術(shù)前(preoperative hepatocellular carcinoma，HCC)組;以病理結(jié)果為肝細胞癌的肝癌術(shù)后患者11例為肝癌術(shù)后(postoperative hepatocellular carcinoma，PHCC)組;肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)(recurrence)組10例。抽取各試驗者2～3 mL靜脈血，3 500 r/min離心5 min，取血清于－70℃保存。

2 儀器及試劑

ABI 7000熒光定量PCR儀(ABI);高速冷凍離心機(中國科技大學(xué)中佳公司);生物安全柜(ESCO);Biophotometer生物分光光度計(Eppendorf);移液器(Eppendorf);miR-122 Taqman探針熒光定量試劑盒和U6 Taqman探針熒光定量試劑盒(上海吉瑪公司);氯仿、異丙醇和無水乙醇(廣州達暉生物技術(shù)有限公司);Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄所需的dNTP、MMLV-逆轉(zhuǎn)錄酶及RNase-free去離子水(Invitrogen)。

3 引物及Taqman探針設(shè)計和合成

根據(jù)miRBase數(shù)據(jù)庫的miR-122基因序列及根據(jù)NCBI中U6 snRNA序列設(shè)計和合成逆轉(zhuǎn)錄莖環(huán)引物、PCR反應(yīng)引物及探針。miR-122 PCR擴增上游引物5'-CAAGCGTTGGAGTGTGACA-3'，下游引物5'-CGTCCTACCATTCTCCAGC-3';Taqman探針序列FAM-CCCACAGACGGCAAACACCATT-BHQ1。內(nèi) 參照U6 snRNA PCR擴增上游引物5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3'，下游引物 5'-GGAACGCTTCACGAATTTG-3';Taqman探針序列FAM-TGCGCAAGGATGACACGCA-BHQ1。以上引物及探針由上海吉瑪公司合成。

表1 研究對象詳細資料Table 1.Detail data of the subjects in the study

4 總RNA提取

取300 μL血清，加入1 mL TRIzol試劑反復(fù)吹打后，常溫放置20～30 min。12 000 r/min離心 10 min，取上清。加入200 μL氯仿每1 mL TRIzol試劑，蓋好樣品管，劇烈振蕩15 s左右至乳膠狀，室溫放置15 min。12 000 r/min，4℃離心10 min。取另一EP管加入500 μL異丙醇，將上層水相加入混合均勻，4 ℃放置10 min，12 000 r/min，4 ℃離心10 min。移去上清液，每1 mL TRIzol試劑加入1 mL用0.1%DEPC水配制的預(yù)冷75%乙醇，混勻。7 500 r/min，4℃離心15 min。盡量去除上清液，RNA沉淀室溫干燥12 ～15 min，加入 25 μL DEPC 水溶解 RNA，65℃烤箱12 min。

5 總RNA純度和濃度的檢測

取2 μL 總 RNA，加 98 μL RNase-free 去離子水稀釋，在260 nm和280 nm波長下檢測吸光度，若A260/A280為1.8～2.1，取 RNA 濃度為25～50 ng/μL進行下一步實驗。

6 miR-122及U6的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系

5 ×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液4 μL，dNTP(10 mmol/L)0.75 μL，逆轉(zhuǎn)錄引物(1 μmol/L)1.20 μL，MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶(200 U/μL)0.1 μL，RNasin(40 U/μL)0.15 μL，總 RNA 5 μL，RNase-free 去離子水8.87 μL。反應(yīng)設(shè)一復(fù)孔，以5 μL RNase-free去離子水取代總RNA作為陰性對照。反應(yīng)條件:16℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃ 10 min。

7 Taqman熒光定量PCR反應(yīng)檢測血清中miR-122及U6含量

反應(yīng)體系為20 μL:2×Real-time PCR Mix 10 μL、Primer Set(20 μmol/L)0.40 μL、Taqman 探針(10 μmol/L)0.10 μL、rTaq DNA 聚合酶(5 U/μL)0.25 μL，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 2.00 μL、RNase-free 去離子水7.30 μL。反應(yīng)設(shè)一復(fù)孔，以2 μL RNase-free 去離子水取代cDNA作為空白對照。反應(yīng)條件:95℃ 3 min;95℃ 12 s，62℃ 40 s，40個循環(huán)?；虮磉_變化倍數(shù)采用 2－ΔΔCt法進行比較，ΔΔCt=(實驗組CtmiR-122－實驗組CtU6snRNA)－(對照組CtmiR-122－對照組CtU6snRNA)。以miR-122表達量最低的一組作為對照組。

8 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。將2－ΔΔCt進行對數(shù)轉(zhuǎn)換后，經(jīng)K-S檢驗檢測數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布，Levene檢驗檢測數(shù)據(jù)具有方差齊性(P＞0.1)，因此選用One-way ANOVA檢驗作統(tǒng)計分析。用兩獨立樣本t檢驗和Pearson相關(guān)分析檢測血清miR-122與其它血清指標的關(guān)系。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 實時熒光定量PCR檢測結(jié)果

陽性曲線和患者血清miR-122及U6 snRNA的反應(yīng)曲線呈標準S型，陰性和空白對照產(chǎn)生的微弱非特異信號呈不規(guī)則曲線。U6 snRNA在所有標本中都有表達，其Ct值波動于26.70±1.08，可作為本實驗的內(nèi)參照，見圖1。

Figure 1.The amplification curves of real-time fluorescence quantitative PCR.A:miR-122 standard positive curve;B:miR-122 curve of hepatitis C patients;C:miR-122 curve of hepatitis B patients;D:miR-122 curve of preoperative hepatocellular carcinoma patients;E:miR-122 curve of healthy controls;F:U6 snRNA curve of hepatitis C patients;G:U6 snRNA curve of hepatitis B patients;H:U6 snRNA curve of preoperative hepatocellular carcinoma patients;I:U6 snRNA curve of healthy controls;J:U6 snRNA curve of negative control;K:U6 snRNA curve of blank control.圖1 實時熒光定量PCR擴增曲線

2 血清miR-122與肝臟疾病的關(guān)系

經(jīng)One-way ANOVA 檢驗，F(xiàn)=20.01，P＜0.05，可認為5組被檢測者血清中miR-122的表達水平不同。經(jīng)多個樣本均數(shù)間兩兩比較的SNK-q檢驗，HCC組、hepatitis B組、hepatitis C組和recurrence組患者血清中miR-122表達水平均高于HC組及PHCC組(P＜0.05)，HCC組、hepatitis B組和recurrence組患者血清中miR-122表達水平低于hepatitis C組(P＜0.05)，HCC組、hepatitis B組和 recurrence組患者血清miR-122的表達沒有明顯差異(P＞0.05)，HC組和PHCC組血清miR-122的表達沒有明顯差異(P ＞0.05)，見表2。

3 血清miR-122與其它血清指標的關(guān)系

3.1 與血清HBsAg的關(guān)系 經(jīng)兩獨立樣本t檢驗檢測，HCC組、hepatitis B組、PHCC組和 recurrence組血清HBsAg(+)和HBsAg(－)患者血清miR-122的表達有顯著差異(P＜0.05)，HBsAg(+)組血清miR-122的表達高于HBsAg(－)組，見表2。

3.2 與血清HBeAg的關(guān)系 經(jīng)兩獨立樣本t檢驗檢測，hepatitis B組、HCC組、PHCC組和 recurrence組中血清HBeAg(+)和HBeAg(－)者血清miR-122的表達有顯著差異(P＜0.05)，HBeAg(+)組血清miR-122的表達高于HBeAg(－)組，見表2。

3.3 與血清HCV-Ab的關(guān)系 經(jīng)兩獨立樣本t檢驗，hepatitis C組和 HCC組血清 HCV-Ab(+)與HCV-Ab(－)者血清 miR-122的表達有差異(P＜0.05)，血清HCV-Ab(+)組血清miR-122的表達高于HCV-Ab(－)組，見表2。

3.4 與血清ALT的關(guān)系 經(jīng)Pearson相關(guān)分析，血清miR-122與血清ALT的相關(guān)系數(shù)r=0.34(P＜0.05)，即血清miR-122的表達與血清ALT活性有正相關(guān)關(guān)系。

3.5 與血清AFP的關(guān)系 經(jīng)兩獨立樣本t檢驗檢測，HCC組、PHCC組和 recurrence組中血清 AFP≥400 μg/L 和AFP ＜400 μg/L 者血清 miR-122的表達有顯著差異(P＜0.05)，血清 AFP≥400 μg/L組血清miR-122的表達高于AFP＜400 μg/L組，見表2。

表2 Taqman探針實時熒光定量PCR檢測血清miR-122的表達情況Table 2.The level of serum miR-122 detected by Taqman probe real-time fluorescence quantitative PCR(mean±SD)

討 論

本實驗設(shè)計了莖環(huán)引物及Taqman探針，利用實時熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)肝癌術(shù)前組血清miR-122的表達水平高于正常對照組，肝癌術(shù)后組血清miR-122的表達比術(shù)前明顯降低，與Peng等［5］研究基本相符。Xu等［6］認為乙型肝炎患者血清 miR-122的表達高于肝癌患者，而Peng等［5］則認為兩者的差異處于邊界(P=0.043)，但本實驗認為肝癌術(shù)前組血清miR-122的表達與乙型肝炎組沒有明顯差異。其中原因可能是由于研究對象、實驗方法、內(nèi)參照的選擇以及數(shù)據(jù)的處理存在差異，Xu等采用的是SYBR Green染料法、以miR-181為內(nèi)參照;Peng等其研究對象血清ALT有明顯差異(P＜0.01)、以miR-16為內(nèi)參照。眾所周知，血清ALT是肝臟損害的生物指標之一，本研究證實miR-122與ALT存在正相關(guān)關(guān)系，實驗中肝癌術(shù)前組血清ALT與乙型肝炎組有差異(P＜0.05)，推測血清ALT的水平和肝臟損害程度影響著miR-122的表達。另外，探針法的特異性及重復(fù)性高于染料法，莖環(huán)引物也有利于提高本實驗檢測的特異性。目前檢測循環(huán)miRNA時內(nèi)參照的選擇沒有得到統(tǒng)一，本研究以U6 snRNA為內(nèi)參照，實驗結(jié)果表明U6 snRNA在血清中表達穩(wěn)定。同時，有學(xué)者認為U6 snRNA在同一個體血清和血漿中豐度相對穩(wěn)定，可適用于循環(huán)miRNA的檢測［7］。

丙型肝炎患者血清miR-122含量高于乙型肝炎屬于首次發(fā)現(xiàn)，其臨床意義有待研究。導(dǎo)致這2種肝炎患者血清miR-122表達差異的原因可能是miR-122在這2種肝炎的作用機制不同和選擇的標本中肝炎病毒的高表達。在乙型肝炎肝臟細胞中，miR-122通過方向調(diào)節(jié)cyclin G1，阻斷 cyclin G1與 P53途徑，間接抑制乙型肝炎病毒的復(fù)制［8］;在丙型肝炎中，miR-122高表達能增強丙肝病毒的復(fù)制［9］。本實驗2種肝炎病毒含量較高:乙型肝炎組HBV-DNA含量于1.02×105～3.61×1010U/L之間，均數(shù)6.81×109U/L;丙型肝炎組HCV-RNA含量于8.56×105～2.35×109U/L之間，均數(shù)6.32×109U/L。推測乙型肝炎組HBV-DNA的高含量可能由于乙型肝炎病毒被miR-122抑制作用減弱，即miR-122的表達相對不足導(dǎo)致的;而丙型肝炎組中HCV-RNA的高含量則是由于miR-122的高表達。另外，本實驗肝癌患者大部分為乙型肝炎病毒相關(guān)的肝癌，同樣，估計由于上述的原因?qū)е赂伟┙M患者血清miR-122低于丙型肝炎組。

乙型肝炎病毒抗原性與血清miR-122的表達有關(guān)，Zhu［10］等認為miR-122對乙型肝炎病毒抗原蛋白有調(diào)節(jié)作用，HBsAg陽性是乙型肝炎病毒感染的標志之一，HBsAg陽性患者血清miR-122高于HBsAg陰性患者(P ＜0.05)，Novellino等［11］研究表明循環(huán)血中HBsAg參與肝癌相關(guān)miRNAs的運載，有9種miRNAs與HBsAg免疫復(fù)合物有關(guān)，同樣發(fā)現(xiàn)miR-122在HBsAg陽性患者血清中升高。與本實驗結(jié)果相符，Ji等［12］檢測到慢性乙型肝炎患者HBeAg陽性患者血清miR-122的表達高于HBeAg陰性者。本實驗認為在乙型肝炎病毒相關(guān)肝癌中上述結(jié)論同樣成立。

AFP作為肝癌的檢測指標，AFP≥400 μg/L，能排除妊娠、生殖系胚胎源性腫瘤、活動性肝病及轉(zhuǎn)移性肝癌，并能觸及腫大、堅硬及有大結(jié)節(jié)狀腫塊的肝臟或影像學(xué)檢查有肝癌特征的占位性病變，作為肝癌診斷標準之一。本研究證實肝癌術(shù)前和術(shù)后患者血清AFP≥400 μg/L者血清miR-122的表達水平高于AFP ＜400 μg/L 者(P ＜0.05)。Kojima等［13］認為miR-122/CUX1/miR-214/ZBTB20通路調(diào)節(jié) AFP的表達，miR-122/CUX1/RhoA通路影響肝癌的惡性程度，AFP水平可能是肝癌組織miR-122低表達的反映，肝癌組織中miR-122呈現(xiàn)低表達［14］，與血清標本截然相反。有學(xué)者認為細胞內(nèi)外miRNA表達圖譜是不一樣的，miRNA從組織釋放到血清具有選擇性［15］，這種選擇性可能是肝癌血清與肝癌組織miR-122表達不同和肝臟疾病患者血清miR-122產(chǎn)生差異的原因。

總之，miR-122作為一種肝臟特異性miRNA，在肝癌術(shù)前、乙型病毒肝炎及丙型病毒肝炎等肝臟疾病患者血清中升高，在肝癌術(shù)后患者血清中表達水平明顯降低，達到正常對照組水平，肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)者升高，而且丙型肝炎含量高于乙型肝炎患者。這對肝臟疾病，尤其是肝癌的診斷、治療及手術(shù)預(yù)后判斷有重要意義。

［1］ 吳瑞珊，溫旺榮.外周血 miRNA的診斷意義［J］.分子診斷與治療雜志，2012，4(2):131-136.

［2］ 李育敏，費 嘉.MicroRNA與血液系統(tǒng)腫瘤發(fā)生、診斷和治療［J］.中國病理生理雜志，2009，25(11):2225-2229.

［3］ Lawrie CH，Gal S，Dunlop HM，et al.Detection of elevated levels of tumour-associated microRNAs in serum of patients with diffuse large B-cell lymphoma［J］.Br J Haematol，2008，141(5):672-675.

［4］ Wu X，Wu S，Tong L，et al.miR-122 affects the viability and apoptosis of hepatocellular carcinoma cells［J］.Scand J Gastroenterol，2009，44(11):1332-1339.

［5］ Peng Q，Shu QC，Hao W，et al.Serum microRNAs as biomarkers for hepatocellular carcinoma in Chinese patients with chronic hepatitis B virus infection［J］.PLoS One，2011，6(12):e28486.

［6］ Xu J，Wu C，Che X，et al.Circulating microRNAs，miR-21，miR-122，and miR-223，in patients with hepatocellular carcinoma or chronic hepatitis［J］.Mol Carcinog，2011，50(2):136-142.

［7］ 王丹妮，黃世峰，府偉靈，等.肝損傷相關(guān)循環(huán)miRNAs檢測方法的建立與初步應(yīng)用［J］.中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2011，21(10):1985-1987.

［8］ Wang S，Qiu L，Yan X，et al.Loss of microRNA 122 expression in patients with hepatitis B enhances hepatitis B virus replication through cyclin G1-modulated P53 activity［J］.Hepatology，2012，55(3):730-741.

［9］ Kambara H，F(xiàn)ukuhara T，Shiokawa M，et al.Establishment of a novel permissive cell line for the propagation of hepatitis C virus by expression of microRNA miR122［J］.J Virol，2012，86(3):1382-1393.

［10］ Zhu L，Chen Z，Chen JZ，et al.Effects of miR-122 on expression of hepatitis B virus proteins［J］.Zhejiang Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban，2011，40(6):593-597.

［11］ Novellino L，Rossi RL，Bonino F，et al.Circulating hepatitis B surface antigen particles carry hepatocellular microRNAs［J］.PLoS One，2012，7(3):e31952.

［12］ Ji F，Yang B，Peng X，et al.Circulating microRNAs in hepatitis B virus-infected patients［J］.J Viral Hepat，2011，18(7):e242-e251.

［13］ Kojima K，Takata A，Vadnais C，et al.MicroRNA122 is a key regulator of α-fetoprotein expression and influences the aggressiveness of hepatocellular carcinoma［J］.Nat Commun，2011，2:338.

［14］ Liu ZR，Chen XW，Qiao XH，et al.Detection of miR-122a and miR-224 expression in hepatocellular carcinoma by real-time fluorescence quantitative RT-PCR［J］.Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao，2009，29(4):751-753.

［15］ Pigati L，Yaddanapudi SC，Iyengar R，et al.Selective release of microRNA species from normal and malignant mammary epithelial cells［J］.PLoS One，2010，5(10):e13515.