陳慧中， 卜欠欠， 孔衛(wèi)東， 曾慧蘭， 李 陽(yáng)， 劉宏偉

牙周膜成纖維細(xì)胞(periodontal ligament fibroblasts，PDLFs)是牙周膜中數(shù)量最多、功能最重要的細(xì)胞之一，參與膠原蛋白的合成與吸收，與基質(zhì)形成、骨質(zhì)形成有關(guān)。吸煙是牙周病尤其是重度牙周病的高危因素，尼古丁占煙草生物堿總量約95%以上，近年來(lái)尼古丁對(duì)牙周組織再生和修復(fù)的毒性研究引起關(guān)注［1］，而其作用機(jī)制尚未十分明確，許多學(xué)者從尼古丁對(duì)PDLFs的堿性磷酸酶變化、蛋白質(zhì)合成、尼古丁型乙酰膽堿受體及細(xì)胞外基質(zhì)影響等方面進(jìn)行研究，證實(shí)尼古丁從多方面影響牙周病的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后［2-4］。本研究擬探討尼古丁對(duì)PDLFs的細(xì)胞形態(tài)、增殖、細(xì)胞周期、凋亡及細(xì)胞因子生成的影響，以進(jìn)一步闡明尼古丁致病機(jī)制。

材料和方法

1 材料

1.1 主要試劑與儀器 人牙周膜成纖維細(xì)胞株(上海拜力生物科技有限公司);尼古丁(北京伊普瑞斯公司);DMEM/F12培養(yǎng)基和澳洲胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS;Gibco);青霉素和鏈霉素(華北制藥公司);MTT、胰酶、碘化丙啶(propidium iodide，PI;Sigma);PI-Annexin V雙染試劑盒(北京寶賽生物技術(shù)公司);CO2培養(yǎng)箱(Thermo Forma);原子力顯微鏡(Thermo);酶標(biāo)儀(BioTek);流式細(xì)胞檢測(cè)儀(BD);透射電鏡(Philips);轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)、細(xì)胞間黏附分子 1(intercellular adhesion molecule 1，ICAM-1)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和血管細(xì)胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule 1，VCAM-1)酶聯(lián)免疫試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司);堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)和胰島素樣生長(zhǎng)因子 I(insulin-like growth factor I，IGF-I)酶聯(lián)免疫試劑盒(華美生物工程有限公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) PDLFs按(1.0～1.5)×106/L的密度接種于T-25培養(yǎng)瓶，含15%FBS的DMEM/F12進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞達(dá)80%融合時(shí)，0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，1∶2或1∶3比例傳代，每3～4 d換液。取3～7代細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)組加15%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液配制的不同濃度尼古丁，對(duì)照組加含15%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液。

2 方法

2.1 細(xì)胞形貌及超微結(jié)構(gòu)觀察 (1)細(xì)胞爬片后，實(shí)驗(yàn)組加0.6 g/L尼古丁孵育24 h，取出蓋玻片，2.5%戊二醛固定10 min，漂洗，風(fēng)干，原子力顯微鏡觀察;(2)PDLFs以6×108/L接種培養(yǎng)，細(xì)胞達(dá)80%融合，實(shí)驗(yàn)組加0.8 g/L 尼古丁，孵育 24 h，2.5%戊二醛固定4 h，1%鋨酸固定1～2 h，脫水、包埋、切片，3%醋酸鈾－枸櫞酸鉛雙染色，透射電鏡觀察。

2.2 MTT法測(cè)細(xì)胞增殖抑制率 細(xì)胞以3×107/L接種于96孔板，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h。實(shí)驗(yàn)組加尼古丁(0.5、0.8、1.0、1.5 g/L)作用 24、48、72 h，每孔加20 μL MTT，孵育4 h，每孔加=甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)150 μL，酶 標(biāo) 儀 測(cè) 吸 光 度(A490)。計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率進(jìn)行細(xì)胞活性評(píng)價(jià)，細(xì)胞生長(zhǎng)增殖抑制率(%)=(1－實(shí)驗(yàn)組 A490/正常對(duì)照組A490)×100%。

2.3 PI法測(cè)細(xì)胞周期 細(xì)胞以2×108/L接種于6孔板培養(yǎng) 24 h，實(shí)驗(yàn)組加尼古丁(0.2、0.4、0.6 g/L)孵育24 h，冰乙醇固定，PI染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，BD FAC Sort Cell Quest軟件分析結(jié)果。

2.4 Annexin V-FITC/PI雙染測(cè)細(xì)胞凋亡率 實(shí)驗(yàn)組加尼古丁(0.5、1.0、1.5 g/L)孵育 24 h，洗滌，離心，加 200 μL 結(jié)合緩沖液，分別加 2 μL Annexin VFITC 和2 μL PI，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2.5 ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)上清細(xì)胞因子水平 細(xì)胞以2×108/L接種于6孔板培養(yǎng)24 h，實(shí)驗(yàn)組加尼古丁(0.4、0.6、1.0 g/L)，24 h 收上清液 －80 ℃冷藏，按ELISA試劑盒步驟操作，酶標(biāo)儀測(cè)吸光度(A450)，CurveExpert 1.3軟件計(jì)算細(xì)胞因子ICAM-1、VCAM-1、VEGF、TGF-β1、IGF-I和 bFGF 濃度。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mena±SD)表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 尼古丁對(duì)PDLFs表面形貌和超微結(jié)構(gòu)的影響

原子力顯微鏡下見(jiàn)正常細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，胞質(zhì)與胞核邊界清晰，細(xì)胞骨架明顯，表面較粗糙，向四周延伸出數(shù)量不等的偽足樣突起，見(jiàn)圖1A。尼古丁作用后，細(xì)胞縮小，胞質(zhì)中見(jiàn)大量空泡，核膜破壞，胞質(zhì)與胞核邊界模糊，見(jiàn)圖1B。透射電鏡下，正常PDLFs呈圓形或類(lèi)圓形，細(xì)胞膜完整，表面有較多微絨毛和突起，細(xì)胞核有單核或多核，形狀不規(guī)則，核膜清晰，1個(gè)或多個(gè)核仁，核質(zhì)比例大，胞漿含散在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核糖體，線(xiàn)粒體嵴清晰連續(xù)，見(jiàn)圖2A、B、E、G。尼古丁作用后，細(xì)胞表面突起和微絨毛增多，胞內(nèi)大量空泡，水腫明顯。胞核固縮崩解，染色質(zhì)濃縮邊集，見(jiàn)圖2C、D。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張成池，內(nèi)充以低電子密度物質(zhì)，見(jiàn)圖2F。線(xiàn)粒體嵴擴(kuò)張，見(jiàn)圖2H，基質(zhì)電子密度增高，部分水腫，余細(xì)胞器未見(jiàn)明顯變化。

Figure 1.Effect of nicotine on surface morphology of PDLFs observed by atomic force microscopy.A1～A3:control group;B1～B3:nicotine(1.0 g/L)group.1:the overall surface morphology;2，3:the enlarged areas.圖1 尼古丁對(duì)PDLFs表面形貌的影響

Figure 2.Ultrastructure of PDLFs observed by transmission electron microscopy.A，B:overall morphology in control group.C，D:overall morphology in nicotine group;E:mitochondria in control group;F:mitochondria in nicotine group;G:endoplasmic reticulumin in control group;H:endoplasmic reticulum in nicotine group.A，C:×3 700;B，D:×8 900;E，F(xiàn):×17 500;G，H:×24 000.圖2TEM觀察PDLFs超微結(jié)構(gòu)

2 尼古丁對(duì)PDLFs增殖抑制率的影響

不同濃度尼古丁(0.5、0.8、1.0、1.5 g/L)作用24、48、72 h，均抑制細(xì)胞增殖，呈時(shí)間和濃度依賴(lài)性(P ＜0.05)，見(jiàn)表1、2。

3 尼古丁對(duì)PDLFs細(xì)胞周期的影響

0.2 、0.4、0.6 g/L 尼古丁作用24 h 后，隨濃度增高，各組細(xì)胞G0/G1期比例逐漸增高(P＜0.05)，S期和G2期比例則呈下降趨勢(shì)，見(jiàn)圖3、表3。

表1 不同濃度尼古丁對(duì)PDLFs增殖的影響Table 1.Effects of different concentrations of nicotine on proliferation of PDLFs(A490.Mean ± SD.n=3)

表2 不同濃度尼古丁作用PDLFs的抑制率Table 2.Inhibitory rate of PDLFs after treatment with nicotine at different concentrations(mean±SD.n=3)

4 尼古丁對(duì)PDLFs凋亡率的影響

0.5 、1.0、1.5 g/L尼古丁作用細(xì)胞24 h后，細(xì)胞凋亡率均高于對(duì)照組。對(duì)照組早期凋亡比率為(0.700±0.566)%;0.5 g/L組、1.0 g/L組與1.5 g/L組早期凋亡比率分別為(0.750±0.495)%、(0.750±0.495)%和(1.600±0.990)%，雖然高于對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)圖4。

5 尼古丁對(duì)細(xì)胞因子分泌水平的影響

不同濃度尼古丁細(xì)胞作用后，bFGF水平下降，0.6 g/L尼古丁組與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);IGF－I水平下降，呈濃度依賴(lài)性(P ＜0.05);ICAM-1水平上升(P ＜0.05)，見(jiàn)表4。VCAM-1水平上升，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05);TGF-β1水平上升，1.0 g/L尼古丁組與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，VEGF水平上升，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)，見(jiàn)表 5。

討 論

牙周膜是位于牙骨質(zhì)和牙槽骨之間的纖維連接組織。PDLFs具多種生物學(xué)功能，不僅合成膠原、基質(zhì)、彈力纖維和糖蛋白，還可分化為成牙骨質(zhì)細(xì)胞、成骨細(xì)胞，形成牙骨質(zhì)、牙槽骨等，尚有吸收膠原吞噬異物的能力，對(duì)平衡牙周膜結(jié)構(gòu)和功能，維持、再生和損傷修復(fù)牙齒支持組織起重要作用。PDLFs的數(shù)量、形態(tài)、增殖是其生物學(xué)活性如黏附、生物合成和分化等的必要保證。煙草中含4 000多種毒素，如尼古丁、CO、亞硝基胺等，其中主要成分尼古丁對(duì)PDLFs的氧化損傷引起關(guān)注。吸煙后牙周局部尼古丁濃度增高［5］，使細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基陡增，消耗GSH 等抗氧化物質(zhì)［6］，致細(xì)胞凋亡［7］。吸煙者牙周炎區(qū)段數(shù)高于非吸煙者，且煙量可影響牙周病，即重度吸煙者的牙周炎區(qū)段數(shù)高于輕、中度吸煙者［8-9］。本研究顯示尼古丁抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡主要以影響PDLFs膜性結(jié)構(gòu)(線(xiàn)粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng))破壞為主，導(dǎo)致細(xì)胞蛋白合成和有氧呼吸功能受損，影響細(xì)胞活性與功能，造成不可逆損傷，從而減弱PDLFs黏附遷移能力，導(dǎo)致牙周病。而細(xì)胞內(nèi)骨架改變可反映外部的刺激作用［9］，至于尼古丁對(duì)細(xì)胞周期和凋亡率的影響，雖然DNA合成阻滯于G0/G1期，并呈劑量依賴(lài)性，但與對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，所以，影響凋亡主要以致膜性結(jié)構(gòu)破壞為主。

Figure 3.Cell cycle distribution of PDLFs treated with nicotine for 24 h.A:control group;B:nicotine(0.2 g/L)group;C:nicotine(0.4 g/L)group;D:nicotine(0.6 g/L)group.圖3 尼古丁作用PDLFs 24 h后細(xì)胞周期的變化

表3 不同濃度的尼古丁干預(yù)PDLFs 24 h后細(xì)胞周期的變化Table 3.Cell cycle distribution of PDLFs treated with nicotine at various concentrations for 24 h(%.Mean±SD.n=3)

Figure 4.Apoptotic rate of PDLFs treated with nicotine at various concentrations for 24 h.A:control group;B:nicotine(0.5 g/L)group;C:nicotine(1 g/L)group;D:nicotine(1.5 g/L)group.圖4 不同濃度尼古丁作用PDLFs 24 h后的凋亡率

表4 尼古丁對(duì)PDLFs分泌bFGF、IGF-I和ICAM-1的影響Table 4.Effects of nicotine on secretion of bFGF，IGF-I and ICAM-1 in PDLFs(mean±SD.n=3)

表5 不同濃度尼古丁對(duì)PDLFs分泌VCAM-1、TGF-β1和VEGF的影響Table 5.Effects of nicotine on secretion of VCAM-1，TGF-β1and VEGF in PDLFs(ng/L.Mean±SD.n=3)

尼古丁尚可在細(xì)胞水平干擾損害免疫細(xì)胞功能，影響牙周病進(jìn)程。bFGF可促進(jìn)牙周細(xì)胞增殖，促進(jìn)牙周創(chuàng)傷愈合早期血管網(wǎng)的形成［10］。其分泌水平下降，牙周組織修復(fù)受到抑制。杜克難等［11］報(bào)道bFGF可誘導(dǎo)胚胎早期中胚層的生長(zhǎng)，有促進(jìn)口腔唇部軟組織創(chuàng)傷愈合的作用。IGF-I有多種生物學(xué)活性，包括促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化及創(chuàng)口愈合等，有強(qiáng)烈的促進(jìn)PDLFs分裂、增殖作用［12］，其機(jī)制可能通過(guò)牙周膜表面的IGF型受體發(fā)揮作用［13］。本實(shí)驗(yàn)表明，尼古丁使PDLFs分泌bFGF和IGF-I水平均下降，抑制了PDLFs分裂和增殖。

ICAM-1是免疫球蛋白超家族成員，調(diào)節(jié)炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，在與白細(xì)胞結(jié)合和向炎癥區(qū)域轉(zhuǎn)移中具重要作用［14］。周衛(wèi)輝等［15］報(bào)道尼古丁可增加內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1表達(dá)，促進(jìn)中性粒細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞黏附，在慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)慢性炎癥發(fā)病中起重要作用。VCAM-1激活血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)血管黏附分子，與單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞結(jié)合，從血管內(nèi)壁移行至炎癥部位，促發(fā)炎癥。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示尼古丁使PDLFs分泌ICAM-1和VCAM-1水平上升，提示尼古丁可能促進(jìn)牙周炎癥發(fā)生。

TGF-β1能調(diào)節(jié)牙周組織的免疫應(yīng)答，促進(jìn)牙周膜細(xì)胞增殖，增加成纖維細(xì)胞合成膠原及纖維黏連素，減少基質(zhì)金屬蛋白酶和纖溶酶激活劑的合成和結(jié)締組織的破壞，使牙周軟、硬組織修復(fù)再生［16］。炎癥刺激可使VEGF分泌增加，促進(jìn)局部血流和自身分泌，促血管增殖。但吸煙者的牙周處于缺氧狀態(tài)，VEGF的高表達(dá)雖可促進(jìn)血管生成，但正調(diào)節(jié)的VEGF mRNA及其蛋白又可募集破骨細(xì)胞，加速牙槽骨吸收［17］。本實(shí)驗(yàn)顯示TGF-β1和VEGF濃度上升，有利于牙周組織修復(fù)。VEGF變化的意義尚需進(jìn)一步研究。

綜上所述，尼古丁改變PDLFs細(xì)胞形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)，抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)凋亡，影響其黏附功能;使PDLFs分泌bFGF和IGF-I水平下降，抑制PDLFs增殖;使ICAM-1和VCAM-1分泌增加，破壞牙周組織;而TGF-β1和VEGF等在炎癥刺激后分泌增加則有助于修復(fù)牙周組織。研究顯示VEGF存在雙重作用，在不同環(huán)境中表達(dá)水平有差異，其表達(dá)變化的意義尚待探討。

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