季 政， 郭航遠(yuǎn)△， 池菊芳， 翟小亞， 劉龍斌，3， 孫 荷， 彭 放

血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascular endothelial cells，VECs)和血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)均為參與動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)發(fā)生發(fā)展的重要細(xì)胞。絕大多數(shù)心血管危險(xiǎn)因素會(huì)引起內(nèi)皮功能障礙，且是最早可在AS演變中探測(cè)到的血管病變，與未來的心血管事件也密切相關(guān)［1］。內(nèi)皮功能障礙首先主要表現(xiàn)為一氧化氮(nitric oxide，NO)合成下降，而NO能抑制血小板黏附、聚集及白細(xì)胞遷移入血管壁，抑制平滑肌細(xì)胞增殖等AS發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵事件［1］。Chen 等［2］發(fā)現(xiàn)在血管內(nèi)皮細(xì)胞中，NO通過活化轉(zhuǎn)錄激活因子3(activating transcription factor 3，ATF-3)干擾p53結(jié)合到啟動(dòng)子區(qū)域，從而抑制基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)的轉(zhuǎn)錄。

同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)是目前公認(rèn)與冠狀動(dòng)脈，腦動(dòng)脈中AS相關(guān)的一個(gè)重要的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［3-4］。血漿Hcy升高涉及遺傳、藥物、營養(yǎng)等多方面，而維生素B12(vitamin B12，VitB12)與葉酸是Hcy代謝過程中必需的輔酶，缺乏將導(dǎo)致血漿總Hcy水平上升，分為輕度(15～30 μmol/L)、中度(30～100 μmol/L)和重度(＞ 100 μmol/L)。研究表明補(bǔ)充VitB6、VitB12和葉酸可降低其水平。

流行病學(xué)的研究顯示過量飲酒有損健康，但經(jīng)常少量、適度飲酒與心血管風(fēng)險(xiǎn)卻始終呈負(fù)相關(guān)［5］。目前國內(nèi)對(duì)黃酒的研究表明其具有抗氧化、降低血膽固醇水平和免疫調(diào)節(jié)等功效［6］，但有關(guān)黃酒對(duì)心血管系統(tǒng)的保護(hù)效應(yīng)及潛在機(jī)制的研究仍十分有限。我們前期的體外實(shí)驗(yàn)表明黃酒能抑制Hcy誘導(dǎo)的大鼠VSMCs MMP-2的表達(dá)和活性［7］，體內(nèi)研究表明黃酒和紅葡萄酒能抑制低密度脂蛋白受體敲除(LDLR-/-)小鼠MMP-2表達(dá)和動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成［8］。鑒于VECs在AS發(fā)生發(fā)展中的重要作用，本實(shí)驗(yàn)主要研究對(duì)Hcy誘導(dǎo)的大鼠VECs MMP-2的表達(dá)和活性的影響及少量黃酒對(duì)其的抑制作用，并探討黃酒可能的抗AS機(jī)制。

材料和方法

1 動(dòng)物和試劑

SD大鼠(18 d)購自浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。酒精度12%的黃酒、酒精購自紹興黃酒集團(tuán)，酒精度12%的紅葡萄酒購自法國Languedoc-Roussillon;M199培養(yǎng)基、胎牛血清和0.25%胰蛋白酶-EDTA購自Gibco;Ⅰ型膠原酶、明膠和D-L-Hcy購自Sigma;血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)購自 PeproTech;內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基(endothelial cell medium，ECM)及生長(zhǎng)補(bǔ)充因子(endothelial cell growth supplement，ECGS)購自 ScienCell;兔抗大鼠Ⅷ因子Ⅰ抗、Ⅱ抗購自上?；蚩萍脊?MTT購自Amresco;鼠尾膠原蛋白I型購自杭州生友生物;鼠抗MMP-2單克隆抗體購自Abcam;HRP兔/鼠通用型Ⅱ抗購自DAKO;其它免疫印跡相關(guān)試劑購自江蘇碧云天;YM30蛋白濃縮膜購自Millipore;其它化學(xué)試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

2 大鼠VECs的培養(yǎng)、分組和干預(yù)

參考Kobayashi等［9］并作相應(yīng)改良，取18 d左右SD大鼠2只，乙醚麻醉后乙醇浸泡2 min消毒，迅速在超凈工作臺(tái)中分離得到光滑完整的大鼠胸腹主動(dòng)脈，顯微剪剪開主動(dòng)脈內(nèi)膜向下貼附在裝有少量0.1%Ⅰ型膠原酶溶液的玻璃皿上，37℃靜置消化30 min，1 000 r/min 離心 5 min 收集 VECs，0.2% 鼠尾膠原包被的6孔板中培養(yǎng)，3～4 d后，更換ECM，繼續(xù)培養(yǎng)5～6 d可見90% 以上細(xì)胞匯合成單層。玻璃探針鏡下刮除少量成纖維樣細(xì)胞進(jìn)行分離純化，D-Hanks液洗滌后，胰酶消化傳代。對(duì)原代及第2代細(xì)胞進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定。取第2代細(xì)胞接種于50 mL底面鋪鼠尾膠原的培養(yǎng)瓶中，加ECM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，待細(xì)胞融合80%左右，換無血清ECM繼續(xù)培養(yǎng)12 h，使細(xì)胞增長(zhǎng)同步后接種在含10%FBS ECM的6孔板中，細(xì)胞計(jì)數(shù)，每孔加VECs 2×105個(gè)，臺(tái)盼藍(lán)染色鏡下測(cè)得細(xì)胞存活率約98%。(1)Hcy對(duì)VECs MMP-2蛋白表達(dá)和上清液酶活性的影響:按 Hcy 濃度梯度分為 0 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L、500 μmol/L、1 000 μmol/L 5 組，與VECs培養(yǎng)48 h，結(jié)合人體實(shí)際病理生理情況及實(shí)驗(yàn)敏感性選取Hcy最適刺激濃度;(2)取最適濃度Hcy(100 μmol/L)與 VECs 培養(yǎng) 24 h、48 h、72 h，選取Hcy最適刺激時(shí)間;(3)黃酒和紅酒抑制Hcy誘導(dǎo)的MMP-2表達(dá)及活化:實(shí)驗(yàn)分為 control組、Hcy組(Hcy 100 μmol/L)、Hcy+ 黃酒組(Hcy 100 μmol/L，酒精度1.4%)、Hcy+紅酒組(Hcy 100 μmol/L，酒精度 1.4%)和 Hcy+ 酒精組(Hcy 100 μmol/L，酒精度1.4%)，與VECs培養(yǎng)48 h后，收集上清液，裂解蛋白，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3 MTT檢測(cè)酒類干預(yù)適宜濃度

消化對(duì)數(shù)期的VECs，以3×107/L接種在96孔板含10%FBS的ECM中培養(yǎng)，邊緣用無菌PBS填充，24 h后干預(yù)。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，酒類干預(yù)濃度介于 1% ～2% 之間，實(shí)驗(yàn)分為 control、Hcy、Hcy+1.0%、Hcy+1.2%、Hcy+1.4%、Hcy+1.6%、Hcy+1.8%和 Hcy+2.0%8 組，加入的 Hcy均為 100 μmol/L。每天換液，48 h后每孔加5 g/L的MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)后吸掉培養(yǎng)液。每孔加入DMSO 150 μL，搖床振蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解，490 nm處測(cè)量各孔的吸光度(A)。每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，2個(gè)零孔(無細(xì)胞，其余同干預(yù)組)。

4 Western blotting檢測(cè)

按照如下處理:(1)加入 0 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L、500 μmol/L、1 000 μmol/L Hcy 與 VECs培養(yǎng)48 h;(2)加入Hcy(100 μmol/L)與 VECs培養(yǎng)24 h、48 h、72 h;(3)實(shí)驗(yàn)分 control組、Hcy 組(Hcy 100 μmol/L)、黃酒組 (Hcy 100 μmol/L，酒精度1.4%)、紅酒組(Hcy 100 μmol/L，酒精度 1.4%)和酒精組(Hcy 100 μmol/L，酒精度 1.4%)，與 VECs培養(yǎng)48 h后，細(xì)胞蛋白裂解上清液以BCA法進(jìn)行蛋白定量后，每道40 μg蛋白上樣于(與5×上樣緩沖液充分混勻后煮沸5 min，4℃ 12 000 r/min離心5 min)SDS-PAGE中恒壓電泳，積層膠60 V，分離膠100 V。電泳結(jié)束后切下分離膠，濕轉(zhuǎn)法100 V約1.5 h轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。電轉(zhuǎn)結(jié)束后，取下膜后先用TBS洗滌3次，每次5 min。然后置于5%脫脂奶粉封閉液中37℃封閉1 h。將膜與封閉液稀釋的Ⅰ抗4℃孵育過夜，TBST平搖洗膜3次，每次15 min，然后與相應(yīng)的Ⅱ抗37℃孵育1 h。TBST洗膜3次，去除未結(jié)合的Ⅱ抗。ECL-Plus化學(xué)發(fā)光處理，于暗室中30 min內(nèi)壓片曝光，顯影及定影后 Bio-Rad Quantity One 4.4軟件定量掃描分析。

5 明膠酶譜法檢測(cè)MMP-2在VECs上清液中的活性

分組及干預(yù)時(shí)間同上，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，低速離心(200×g)去除細(xì)胞碎片，上清用Millipore公司YM30蛋白濃縮膜處理后(1 500×g，4℃離心4 min)，與1/2體積的樣品緩沖液混合均勻后將25 μg樣品上樣于含0.1%明膠的SDS-PAGE電泳。60 V穩(wěn)壓跑濃縮膠，90 V跑分離膠，當(dāng)溴酚藍(lán)遷移到分離膠下游邊緣2 cm時(shí)停止電泳。將凝膠取出，用蒸餾水漂洗數(shù)次后，移入2.5%Triton X-100溶液中(20 mmol Tris-HCl，pH 8.0;150 mmol NaCl;5 mmol CaCl2;2.5%Triton X-100)搖床上50 r/min平搖 30 min×2次洗脫SDS。蒸餾水漂洗后，加入明膠酶緩沖液，在37℃恒溫?fù)u床中溫育42 h。用考馬斯亮藍(lán)R250染色4 h，在脫色液中脫色1～2 h，至對(duì)照出現(xiàn)明顯、清晰的負(fù)染酶帶后用蒸餾水漂洗、拍照，并用Quantity One 4.4軟件定量分析。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)和LSD法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 大鼠VECs培養(yǎng)及鑒定

大鼠胸腹主動(dòng)脈VECs分離純化后培養(yǎng)，原代細(xì)胞8～10 d長(zhǎng)滿匯合后，形態(tài)學(xué)鑒定呈現(xiàn)典型的“鵝卵石”或“鋪路石”征。細(xì)胞免疫化學(xué)鑒定原代和純化后的第2代細(xì)胞特異性Ⅷ因子相關(guān)抗原，可見胞質(zhì)中呈棕黃色陽性表達(dá)，經(jīng)純化后的第2代細(xì)胞未見明顯陰性表達(dá)細(xì)胞。400倍鏡下可見棕色Ⅷ因子相關(guān)抗原顆粒，見圖1。

2 MTT確定酒類干預(yù)的適宜濃度

實(shí)驗(yàn)表明100 μmol/L Hcy對(duì)VECs活性無顯著影響，隨著干預(yù)組酒精濃度的上升VECs活性(A值)下降;3組酒類間同一干預(yù)時(shí)A值無顯著差別，與Hcy組相比，干預(yù)濃度1.8%時(shí)黃酒和紅酒組，VECs活性顯著下降(均P＜0.01);干預(yù)濃度為1.6%時(shí)酒精組VECs活性顯著下降(P＜0.01)。根據(jù)上述結(jié)果統(tǒng)一采用1.4%酒精濃度進(jìn)行干預(yù)，見表1。

Figure 1.The primary culture and immunocytochemical staining of rat aortic vascular endothelial cells.A:a small amount of cells were observable 3 days later(×100).B:the cells were rapidly growing after replacing endothelial cell medium 6 days later(×100).C:the cells grew with the characteristic“cobblestone morphology”when reaching 90%confluence 9 days later(×100).D，E and F:the cells were immunostained with antibody of factorⅧ，the marker of endothelial cells.D:primary cells;E，F(xiàn):passage 2 cells.E:×200;D，F(xiàn):×400.The red arrow showed brown granules in the cytoplasm，indicating positive staining.圖1 大鼠VECs原代培養(yǎng)及免疫細(xì)胞化學(xué)染色

表1 黃酒、紅葡萄酒及酒精對(duì)大鼠VECs活性的影響Table 1.Effects of Chinese rice wine，red wine and ethanol on the viability of rat aortic VECs(mean±SD.n=5)

3 免疫印跡法檢測(cè)MMP-2在VECs中的表達(dá)

Hcy能夠促進(jìn)VECs MMP-2蛋白的表達(dá)，呈現(xiàn)濃度與時(shí)間的依賴性。(1)50～500 μmol/L Hcy促進(jìn)MMP-2蛋白表達(dá)上調(diào)，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05 或 P ＜0.01)，見圖 2。(2)Hcy(100 μmol/L)干預(yù)24、48、72 h均能促進(jìn)MMP-2蛋白表達(dá)，以48 h最明顯(P ＜0.01)，見圖3。(3)與Hcy組比較，黃酒組和紅酒組VECs MMP-2表達(dá)分別下降了29.1%和32.6%(P ＜0.05)，酒精組下降 5.3%(P＞0.05);與酒精組比較，黃酒組與紅酒組MMP-2表達(dá)下降差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);黃酒組與紅酒組之間無顯著差異(P＞0.05)，見圖4。

Figure 2.Effects of Hcy at different concentrations on the expression of MMP-2 in VECs.VECs were treated with Hcy at different concentrations for 48 h，and the MMP-2 protein was examined by Western blotting assay.Mean ± SD.n=5.*P ＜ 0.05，＊＊ P ＜ 0.01 vs control(0 μmol/L Hcy);##P ＜ 0.01 vs 50 μmol/L Hcy;△P ＜0.05 vs 100 μmol/L Hcy.圖2 不同作用濃度的Hcy對(duì)MMP-2蛋白表達(dá)的影響

4 明膠酶譜法檢測(cè)MMP-2在VECs上清液中的酶解活性

50～500 μmol/L Hcy增強(qiáng) MMP-2 的活性，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05或 P ＜0.01)，見圖5。Hcy(100 μmol/L)干預(yù)24、48、72 h 均能促進(jìn) MMP-2活性增強(qiáng)，以 48 h最明顯(P＜0.01)，見圖 6。與Hcy組相比，MMP-2活性黃酒組和紅酒組分別下降31.2%和33.8%(P ＜0.05)，酒精組下降4.6%(P ＞0.05);黃酒組和紅酒組MMP-2活性下降與酒精組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);黃酒組與紅酒組之間無顯著差異(P＞0.05)，見圖7。

討 論

Figure 3.Effects of Hcy treatment for different time on the expression of MMP-2.VECs were incubated with 100 μmol/L Hcy for 24 h，48 h and 72 h.Mean ± SD.n=5.＊＊P ＜0.01 vs control(0 h);##P ＜0.01 vs 24 h.圖3 Hcy作用不同時(shí)間對(duì)MMP-2蛋白表達(dá)的影響

Figure 4.Effect of rice wine on expression of MMP-2 stimulated by Hcy(100 μmol/L，48 h)in cultured VECs.The MMP-2 expression was analysed by Western blotting and normalized with β-actin.Mean ± SD.n=5.＊＊P ＜0.01 vs control;△P ＜0.05 vs Hcy;#P ＜0.05 vs Hcy+ethanol.圖4 黃酒對(duì)Hcy刺激下VECs MMP-2表達(dá)的影響

Figure 5.Effects of different concentrations of Hcy on the activity of MMP-2.VECs were treated with Hcy at different concentrations for 48 h，the MMP-2 activity was examined by gelatin zymography assay.Mean ± SD.n=5.*P ＜0.05，＊＊P ＜ 0.01 vs control(0 μmol/L Hcy);△△P ＜0.01 vs 50 μmol/L Hcy;##P ＜ 0.01 vs 100 μmol/L Hcy.圖5 不同濃度Hcy對(duì)MMP-2活性的影響

Figure 6.Effects of Hcy treatment for different time on the activity of MMP-2.VECs were treated with 100 μmol/L Hcy for 24 h，48 h and 72 h.Mean ± SD.n=5.＊＊P ＜0.01 vs control(0 h);△△P ＜ 0.01 vs 24 h.圖6 Hcy作用不同時(shí)間對(duì)MMP-2活性的影響

Figure 7.Effect of rice wine on the activity of MMP-2 stimulated by Hcy(100 μmol/L，48 h)in cultured VECs.The MMP-2 activity was analysed by gelatin zymography.Mean ±SD.n=5.＊＊P ＜0.01 vs control;△P ＜0.05 vs Hcy;#P ＜0.05 vs Hcy+ethanol.圖7 黃酒對(duì)Hcy刺激下VECs MMP-2活性的影響

基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是一類鋅離子依賴的蛋白水解酶，能裂解幾種細(xì)胞外基質(zhì)成份，如膠原蛋白、酪蛋白、明膠等，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的降解和重建［10-11］。其中以MMP-2分布最廣，主要負(fù)責(zé)降解Ⅳ型膠原和變性膠原，并且 AS斑塊的形成需要MMP-2介導(dǎo)的細(xì)胞外基質(zhì)重建，其表達(dá)上升促進(jìn)VSMCs增殖和遷移至血管內(nèi)膜下，參與AS發(fā)生發(fā)展的過程。在正常血管中，VECs及VSMCs不斷產(chǎn)生MMP-2［7，10-11］。對(duì)人類血管的研究表明，與正常區(qū)域相比MMP-2一般在脂紋和AS斑塊處高表達(dá)，此外還顯示，脂紋、出血和鈣化的纖維粥樣斑塊以及完全閉塞的病變中富含MMP-2［10］。所有這些研究表明，MMP-2在AS病變的發(fā)生和進(jìn)展中起著及其重要的作用。

Hcy增加心血管事件的風(fēng)險(xiǎn)與濃度相關(guān)，其通過一個(gè)涉及激活 MAPK和PI3K-Akt通路增強(qiáng)VSMCs中MMP-2的合成、分泌和活性。這表明Hcy直接參與導(dǎo)致斑塊不穩(wěn)定和重塑的機(jī)制。Bescond等［12］的研究表明 Hcy直接激活 proMMP-2可能是Hcy相關(guān)AS中參與ECM降解的機(jī)制之一。Hcy已被確認(rèn)是AS的獨(dú)立危險(xiǎn)因子之一，國內(nèi)外大量研究已經(jīng)證實(shí)其可以通過多種機(jī)制引起血管內(nèi)皮功能損傷和障礙，刺激MMP-2的表達(dá)，促進(jìn)AS的發(fā)生［13］。本實(shí)驗(yàn)用不同濃度Hcy刺激體外培養(yǎng)的大鼠VECs，發(fā)現(xiàn)Hcy在50～500 μmol/L時(shí)呈濃度依賴性地促進(jìn)MMP-2表達(dá)和增強(qiáng)其活性，在48 h時(shí)作用最明顯(100 μmol/L)，這表明 Hcy可增強(qiáng) VECs MMP-2 的表達(dá)和活性，促進(jìn)AS的發(fā)生。血漿正常Hcy參考范圍為5～15 μmol/L，參考人體實(shí)際病理生理情況(中、重度高Hcy血癥≥100 μmol/L)及實(shí)驗(yàn)敏感性，選取100 μmol/L的Hcy作為刺激和造模濃度。

上世紀(jì)80年代有國外學(xué)者發(fā)現(xiàn)，盡管同樣在日常飲食中攝入了大量的飽和脂肪酸，但法國民眾心血管疾病發(fā)病率和死亡率卻明顯低于歐美其他國家，此即著名的“法國悖論”。1992年，Renaud等［14］經(jīng)過研究后提出，法國民眾愛飲紅酒正是導(dǎo)致人群心血管事件發(fā)病率下降的主要原因，但具體機(jī)制未明。此后，大量對(duì)適量飲用紅葡萄酒心血管保護(hù)作用機(jī)制的研究進(jìn)一步闡明，其中富含的多酚是紅酒發(fā)揮心血管保護(hù)作用的主要有效成分［15-16］，包括兒茶素、表兒茶素、沒食子酸、阿魏酸、咖啡酸、花青素以及白藜蘆醇等多種酚類［16］，具有改善血脂、調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮、改善內(nèi)皮祖細(xì)胞功能、增加血管內(nèi)皮NO的合成、抗凝、抑制VSMCs增殖和遷移以及抑制炎癥因子等作用，能顯著延緩甚至抑制粥樣斑塊的進(jìn)展，最終可以有效減少心肌梗死等嚴(yán)重心血管事件的發(fā)生［15］，其在體外能顯著抑制 MMP-2，MMP-9 在VSMCs的表達(dá)和激活，目前認(rèn)為抑制MMP-2，MMP-9的表達(dá)可能是紅酒心血管保護(hù)作用的機(jī)制之一［17］。由于紅葡萄酒主要通過紅酒多酚來抑制AS的進(jìn)程，而黃酒同樣富含多酚，其主要來自糯米和小麥，包括兒茶素、丁香酸、綠原酸、表兒茶素、阿魏酸、咖啡酸、沒食子酸、p-香豆酸等9種酚類，總酚含量高達(dá)1.023 g/L，與紅酒多酚在種類上幾乎相同且在含量上不相上下［18］。因此我們推測(cè)，黃酒可能也是通過黃酒多酚來發(fā)揮其對(duì)AS病變的抑制作用。

目前國內(nèi)謝廣發(fā)等［18］的研究發(fā)現(xiàn)紹興黃酒中不僅含有豐富的多酚類物質(zhì)，還含有功能性低聚糖、B族維生素、生物活性肽類等多種有益心腦血管健康的成分。功能性低聚糖具有多種重要的生理功能，由于人體不具備分解此糖的酶系，在攝入后不易消化吸收，但它有利于腸道中雙歧桿菌等益生菌的增殖，改善腸道的微生態(tài)環(huán)境，促進(jìn)B族維生素的合成吸收。而研究證實(shí)VitB6和VitB12能顯著降低血漿Hcy水平，我們?cè)谇捌隗w內(nèi)研究少量飲用黃酒對(duì)LDLR-/-小鼠MMP-2表達(dá)和AS斑塊形成作用的影響實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，黃酒組小鼠(高脂飼料+3%黃酒)血漿Hcy濃度較control組(高脂飼料+無菌水)、紅酒組(高脂飼料+3%紅酒)和酒精組(高脂飼料+3%酒精)顯著下降［8］。這表明黃酒具有降低血漿Hcy濃度的功能，鑒于Hcy在AS及MMP-2合成分泌激活中的重要作用，提示我們小劑量黃酒可能通過降低血漿Hcy濃度從而起到對(duì)MMP-2表達(dá)和活性的抑制作用。本實(shí)驗(yàn)中與Hcy組相比，黃酒組和紅酒組一樣MMP-2蛋白表達(dá)和活性明顯下降，酒精組MMP-2蛋白表達(dá)及活性盡管有所下降，但均無顯著差異。這與Walter等［19］發(fā)現(xiàn)紅葡萄酒對(duì)冠心病的保護(hù)效應(yīng)可能涉及紅酒多酚對(duì)MMP-2表達(dá)的抑制作用有關(guān)相一致，表明小劑量黃酒能抑制Hcy刺激下MMP-2表達(dá)的上升，說明黃酒也可能通過與紅葡萄酒相類似的機(jī)制即酒精以外的保護(hù)性成分抑制了MMP-2的表達(dá)，起到對(duì)心血管系統(tǒng)的保護(hù)作用。以上結(jié)果都支持少量黃酒能抑制MMP-2表達(dá)和具有抗AS作用，并與前期研究的結(jié)論一致［7-8］。我們結(jié)合前期體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)推測(cè)，少量飲用黃酒對(duì)粥樣斑塊的抑制作用可能是通過降低血脂和血漿Hcy水平，進(jìn)而抑制參與AS中的兩種主要細(xì)胞 VECs和VSMCs中MMP-2的表達(dá)及其外分泌MMP-2的激活來實(shí)現(xiàn)的［7-8］，并且我們大膽推斷黃酒可能也是通過一種與紅葡萄酒極其相似的機(jī)制即黃酒中的黃酒多酚成分來發(fā)揮其對(duì)AS病變進(jìn)程的抑制作用。針對(duì)黃酒多酚中具體單體成分抗AS作用的研究將在本系列實(shí)驗(yàn)的下一步中展開。

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