曾 榮，陳金印 ，林麗超

(1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院 食品與園藝學(xué)院，廣東 佛山528200;2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，江西 南昌330045)

微生物廣泛分布于自然界，食品在生產(chǎn)、包裝、貯運(yùn)及銷售過程中，不可避免地會(huì)受到一定類型和數(shù)量的微生物污染。當(dāng)環(huán)境條件適宜時(shí)，它們就會(huì)迅速生長繁殖，造成食品的腐敗與變質(zhì)。由于微生物侵染引起的食品腐敗不僅降低了食品的營養(yǎng)和衛(wèi)生質(zhì)量，而且還可能危害人體健康，同時(shí)造成巨大的資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。在生產(chǎn)中一般要添加防腐劑來減少食品的腐敗變質(zhì)，延長貨架期。目前使用最多的為化學(xué)防腐劑，如苯甲酸及其鹽類、山梨酸及其鹽類、硝酸鹽及亞硝酸鹽、對(duì)羥基苯甲酸酯類等。長期的科學(xué)研究和生產(chǎn)實(shí)踐證明，這些化學(xué)防腐劑大多具有潛在毒性和安全隱患。因此，天然無毒、高效安全的食品防腐劑的研究與開發(fā)成為各國食品生產(chǎn)者及科研工作者的研究熱點(diǎn)［1］。

丁香(Eugenia caryophyllata)的干燥花蕾是我國傳統(tǒng)的調(diào)味品和中草藥，其性辛溫，揮發(fā)油的主要成分為丁香酚(eugenol)，具有較強(qiáng)的殺蟲、抑菌和防腐保鮮作用［2－5］。丁香酚是歐盟、美國及中國都允許使用的食品添加劑，由于對(duì)其抑菌譜及使用濃度尚未明確，其在食品工業(yè)并未得到廣泛應(yīng)用。本文旨在通過研究丁香精油及丁香酚對(duì)食品中常見的腐敗菌的抑制活性及量效關(guān)系，為丁香精油和丁香酚作為天然食品保鮮劑的開發(fā)及食品活性包裝提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌種和培養(yǎng)基

沙門氏菌(Salmonella anatum)、大腸桿菌(Escherichia coli)、綠膿假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、宋內(nèi)氏志賀氏菌(Shigella sonnei)、蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)、李斯特菌(Listeria monocytogenes)由佛山市疾控中心提供。培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨，參照周德慶［6］的方法配制。

1.2 丁香精油的制備及丁香酚

丁香購自江西省樟樹市華豐藥業(yè)公司，產(chǎn)地為廣西。將材料于40 ℃烘干，粉碎，過40 目篩，取200 g 粉末加入超臨界流體萃取釜中，萃取溫度為40 ℃、壓力15 MPa、萃取時(shí)間2 h。得到丁香精油42 g。丁香酚購自Sigma 公司。

1.3 主要儀器設(shè)備

FW100 干樣粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)、SPX－250 型生化培養(yǎng)箱(上海楚定分析儀器公司)、SFE 超臨界流體萃取儀(廣州輕工研究所)、YXQ－LS－SⅡ全自動(dòng)電熱高壓蒸汽滅菌鍋(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)、AUY220 電子分析天平(日本島津)、UV－2450 紫外可見分光光度計(jì)(日本島津)、SpectraMax190 酶標(biāo)儀(美谷分子儀器有限公司)。

1.4 菌液的制備

采用比濁法制備各種菌懸液。以上菌種經(jīng)活化接種于試管斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)(37 ℃，24 ～36 h)，用無菌水稀釋，菌液的濃度控制在107～108cfu/mL，備用。

1.5 抑菌活性的測定

結(jié)合杯碟法和雙層平板法測定提取液對(duì)供試菌生長的抑制作用［6］。先倒底層平板，再吸取10 mL制好的菌液，混入冷卻至45 ℃左右90 mL 培養(yǎng)基中，使最終菌液濃度為106～107cfu/mL，制備上層帶菌平板。凝固后在平板上對(duì)稱放置無菌牛津杯，向牛津杯中加入200 μL 丁香精油或丁香酚，進(jìn)行3 次平行實(shí)驗(yàn)，重復(fù)2 次。37 ℃培養(yǎng)24 ～36 h，十字交叉法測量抑菌圈的大小。以0.2%的苯甲酸鈉為陽性對(duì)照(根據(jù)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)GB2760—2011)。

1.6 MIC 及MBC 的測定［7］

用微量稀釋法測定最低抑菌濃度(MIC)及最低殺菌濃度(MBC)。將精油及丁香酚過0.22 μm 微孔過濾器，并用Tween －80 稀釋。吸取100 μL 含菌培養(yǎng)基加入至96 孔板中，再加入100 μL 濃度為5～200 mg/L 丁香酚及丁香精油(梯度為5 mg/L)。置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察菌體的生長情況，細(xì)菌生長完全被抑制時(shí)所對(duì)應(yīng)最低藥物濃度試驗(yàn)孔即為精油及丁香酚的MIC。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，觀察菌體的生長情況，無菌生長的最低樣品濃度即為MBC 值。

質(zhì)控菌株為金黃色葡萄球菌ATCC 25923。

1.7 毒力回歸方程的測定

毒力回歸方程的測定參照唐靜等［8］的方法。

根據(jù)抑制率，查幾率值表，可得抑制率幾率值(Y)，將藥液濃度(mg/mL)換算成濃度對(duì)數(shù)(X)，即可求出線性方程Y=aX+b，根據(jù)線性方程可求出抑制中濃度(IC50)。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用DPS v7.05 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，選擇Ducan 新復(fù)極差法對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 丁香精油及丁香酚對(duì)供試菌的抑菌效果

表1 丁香精油及丁香酚對(duì)供試菌的抑菌效果Tab.1 Antibacterial activity of clove essential oil and eugenol against the tested microorganisms

從表1 可以看出，丁香精油和丁香酚的抑菌譜廣，對(duì)所試的腐敗菌具有較強(qiáng)的抑制作用。除綠膿假單胞菌外，對(duì)其他菌的抑菌圈直徑均為20 mm 以上。與0.2%的苯甲酸鈉溶液相比，丁香精油及丁香酚對(duì)革蘭氏陽性菌的抑制效果明顯優(yōu)于革蘭氏陰性菌，特別是金黃色葡萄球菌及蠟樣芽胞桿菌，抑菌圈直徑超過30 mm，顯著大于陽性對(duì)照苯甲酸鈉的抑菌圈直徑。丁香酚為丁香精油的主要成分，其對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌及李斯特菌的抑制效果顯著大于丁香精油。

2.2 丁香精油及丁香酚對(duì)供試菌的MIC 和MBC

表2 丁香精油及丁香酚對(duì)供試菌的MICTab.2 The MIC of clove essential oil and eugenol against the tested microorganisms

由表2 可知，丁香精油對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC 最低，為20 μg/mL;其次為蠟樣芽胞桿菌，MIC 為25 μg/mL;對(duì)綠膿假單胞菌的MIC 最高，為130 μg/mL。丁香酚對(duì)供試細(xì)菌的MIC 與丁香精油的MIC有較好的相關(guān)性，通過線性分析，其相關(guān)系數(shù)為0.866 1，說明丁香酚為丁香精油中的主要抑菌功效成分。對(duì)照苯甲酸鈉的MIC 均在1 200 μg/mL 以上，根據(jù)國標(biāo)2760—2011 中規(guī)定，苯甲酸鈉在各類食品中的最大使用量為200 ～2 000 μg/g。

表3 丁香精油及丁香酚對(duì)供試菌的MBCTab.3 The MBC of clove essential oil and eugenol against the tested microorganisms

由表3 可以看出，非常低劑量的丁香精油和丁香酚即可完全抑制和殺死食品中的常見腐敗菌，特別是革蘭氏陽性菌。丁香精油和丁香酚具有芳香氣味，其添加到食品中有可能破壞食品的原有風(fēng)味，因此對(duì)其添加量要進(jìn)行控制。通過試驗(yàn)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，丁香精油和丁香酚對(duì)食品中常見腐敗菌的MIC 和MBC 均較低，作為防腐劑的使用劑量并不需要很大，因此對(duì)食品風(fēng)味的破壞可以減少到很低。

表4 丁香精油及丁香酚對(duì)供試菌的毒力回歸方程Tab.4 The regression equation of clove essential oil and eugenol against the tested microorganisms

2.3 丁香精油及丁香酚對(duì)供試菌的毒力回歸方程

通過測定丁香精油及丁香酚對(duì)食品中常見腐敗菌的室內(nèi)毒力，獲得不同濃度處理對(duì)菌落生長抑制作用數(shù)據(jù)，用DPS 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行回歸統(tǒng)計(jì)分析，得出以藥劑濃度對(duì)數(shù)值為X，抑菌率幾率值為Y 的毒力回歸方程和IC50，其結(jié)果見表4。由表可知:丁香精油和丁香酚對(duì)金黃色葡萄球菌及蠟樣芽胞桿菌的毒力最強(qiáng)，丁香精油的IC50分別為4. 383 2 μg/mL、5. 024 4 μg/mL，丁香酚則分別為4. 284 5 μg/mL、4.046 6 μg/mL。兩種物質(zhì)對(duì)綠膿假單胞菌的毒力最弱，IC50分別為26.532 4 μg/mL、25.609 4 μg/mL。

3 結(jié)論與討論

隨著食品工業(yè)的快速發(fā)展及人們消費(fèi)觀念的變革，食品安全成為亟待解決的重要問題?；瘜W(xué)防腐劑如常用的亞硝酸鹽在人體內(nèi)可與仲胺類作用形成亞硝胺類，在體內(nèi)達(dá)到一定劑量時(shí)是致癌、致畸、致突變的物質(zhì)，可嚴(yán)重危害人體健康。因此，生產(chǎn)者和科研工作者都致力于研究和開發(fā)新型的、安全的食品防腐劑。植物精油是存在于植物體中一類具有芳香氣味，在常溫下能揮發(fā)，可隨水蒸氣蒸餾的油狀成分，主要含有酯、醛、酮、酚和萜烯類等物質(zhì)。許多植物精油被證實(shí)具有殺菌消炎、抗氧化的能力，是非常好的潛在食品防腐劑來源［9－11］。丁香精油的對(duì)許多微生物都具有抑制作用，且發(fā)現(xiàn)其能延長西蘭花、黃花菜、草莓、葡萄、桃等果蔬的貯藏保鮮期［12－15］。Go?i 等［13］研究發(fā)現(xiàn)，丁香精油的氣相部分對(duì)E.coli、S.aureus、L.monocytogenes、E.faecalis 具有抑制作用，當(dāng)與桂皮精油混合使用時(shí)，對(duì)E.coli 的抑制存在拮抗作用，而對(duì)L.monocytogenes 等細(xì)菌存在協(xié)同作用。Shan 等［16］研究發(fā)現(xiàn)S. aureus 對(duì)酚類物質(zhì)最為敏感，而E.coli 抗性最強(qiáng)。通過試驗(yàn)，筆者發(fā)現(xiàn)丁香精油及精油中主要成分丁香酚對(duì)食品中常見的腐敗菌具有較強(qiáng)的抑制作用，金黃色葡萄球菌及蠟樣芽胞桿菌對(duì)其非常敏感。

植物精油的抑菌作用早被發(fā)現(xiàn)，但在食品工業(yè)中作為防腐劑應(yīng)用并不廣泛，限制其發(fā)展的重要原因是:精油含有大量芳香性物質(zhì)，具有濃郁的氣味，當(dāng)添加到食品中時(shí)容易破壞食品固有的風(fēng)味［17－18］。解決的方法之一是使用復(fù)方精油，對(duì)兩種以上的精油進(jìn)行復(fù)配，減少使用量，從而降低對(duì)食品風(fēng)味的影響;另外可找出精油中的活性功效成分，對(duì)其進(jìn)行適當(dāng)改性，使抑菌能力增強(qiáng)，亦能降低使用濃度。丁香酚即為丁香精油中的主要抑菌功效成分，尚需深入研究其抑菌機(jī)理及改性途徑，為天然防腐劑的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

［1］Burt Sara.Essential oils:their antibacterial properties and potential applications in foods—a review［J］.International Journal of Food Microbiology，2004，94:223 －253.

［2］李鵬霞，邵世達(dá)，馮俊濤，等.丁香精油和丁香酚對(duì)蘋果貯藏期病害及果實(shí)品質(zhì)的影響［J］. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2006，22(6):173 －177.

［3］Karuppiah Ponmurugan，Rajaram Shyamkumar.Antibacterial effect of allium sativum cloves and zingiber officinale rhizomes against multiple－drug resistant clinical pathogens［J］.Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine，2012:597 －601.

［4］Alves－Silva Jorge M，Santos Sandra M Dias dos，Pintado Manuela E，et al.Chemical composition and in vitro antimicrobial，antifungal and antioxidant properties of essential oils obtained from some herbs widely used in portugal［J］. Food Control，2012，doi:10.1016/j.foodcont.2012.12.022.

［5］Elizaquível Patricia，Sánchez Gloria，Aznar Rosa.Application of propidium monoazide quantitative pcr for selective detection of live Escherichia coli o157:H7 in vegetables after inactivation by essential oils［J］.International Journal of Food Microbiology，2012，159:115 －121.

［6］周德慶.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程［M］.2 版，北京:高等教育出版社，2008.

［7］Montes－Belmont R，Carvajal M J.Control of aspergillus flavus in maize with plant essential oils and their components［J］.Journal of Food Protection，1998，61(5):616 －619.

［8］唐靜，談滿良，趙江林，等.多孔板－mtt 比色法測定植物抗菌成分對(duì)細(xì)菌的抑制活性［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2008(6):1 －6.

［9］Roger Randrianarivelo，Samira Sarter，Eric Odoux，et al.Composition and antimicrobial activity of essential oils of cinnamosma fragrans［J］Food Chemistry，2009，114:680 －684.

［10］Plooy Wilma du，Regnier Thierry，Combrinck Sandra.Essential oil amended coatings as alternatives to synthetic fungicides in citrus postharvest management［J］.Postharvest Biology and Technology，2009，53:117 －122.

［11］Yang E J，Kim S S，Moon J Y，et al.Inhibitory effects of fortunella japonica var.Margarita and citrus sunki essential oils on nitric oxide production and skin pathogens［J］.Acta Microbiol Immunol Hung，2010，57(1):15 －27.

［12］Lu Fei，Ding Yi Cheng，Ye Xing Qian，et al.Antibacterial effect of cinnamon oil combined with thyme or clove oil［J］.Agricultural Sciences in China，2011，10(9):1482 －1487.

［13］Go?i P，López P，Sánchez C，et al.Antimicrobial activity in the vapour phase of a combination of cinnamon and clove essential oils［J］.Food Chemistry，2009，116:982 －989.

［14］Tian Jun，Huang Bo，Luo Xiu li，et al.The control of Aspergillus flavus with cinnamomum jensenianum hand－mazz essential oil and its potential use as a food preservative［J］.Food Chemistry，2012，130:520 －527.

［15］Gülin Ilhami，Elmastas Mahfuz，Aboul －Enein Hassan Y.Antioxidant activity of clove oil – a powerful antioxidant source［J］.Arabian Journal of Chemistry，2012，5:489 －499.

［16］Shan Bin，Cai Yi Zhong，Brooks John D，et al.The in vitro antibacterial activity of dietary spice and medicinal herb extracts［J］.International Journal of Food Microbiology，2007，117:112 －119.

［17］Espina Laura，García－Gonzalo Diego，Laglaoui Amin，et al.Synergistic combinations of high hydrostatic pressure and essential oils or their constituents and their use in preservation of fruit juices［J］.International Journal of Food Microbiology，2013，161:23 －30.

［18］Manso S，Cacho－Nerin F，Becerril R，et al.Combined analytical and microbiological tools to study the effect on aspergillus flavus of cinnamon essential oil contained in food packaging［J］.Food Control，2013，30:370 －378.