孔建明

（袁浦社區(qū)衛(wèi)生服務中心中醫(yī)科，浙江 杭州 310024）

傳統(tǒng)中藥馬錢子，為馬錢子科植物馬錢子的干燥成熟種子，具有通絡止痛、散結消腫的功效。馬錢子堿 (Brucine)是從馬錢子中提取的吲哚型結構的生物堿，是一種白色晶體，是馬錢子組成和發(fā)揮藥效的主要成分之一［1］。研究顯示馬錢子堿的藥理活性主要集中在鎮(zhèn)痛作用［2-4］、抗炎及免疫系統(tǒng)作用［5-8］、心血管作用［9-11］和抗腫瘤作用［12-14］等幾個方面。

婦科腫瘤已成為全球婦女的頭號惡性腫瘤疾病。近年來關于婦科腫瘤與雌激素分泌表達異常之間的分子調控機制已成為國內(nèi)外研究的重點。臨床及實驗研究均認為雌激素可通過雌激素受體調節(jié)機體的多種信號途徑，引起內(nèi)皮細胞增殖、凋亡、運動、芽生、黏附等特性改變，導致腫瘤血管生成的異常，從而最終影響到腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉移過程。宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，其病死率在所有婦女癌癥病死率中位居第二，且近年來宮頸癌發(fā)病率存在逐年增加和發(fā)病年齡日趨年輕化的問題［15］，因此研究藥物的抗宮頸癌活性具有重要意義。

本研究通過檢測雌二醇、馬錢子堿以及兩者聯(lián)合作用分別對HeLa細胞生長的增殖和抑制作用，探討可能的作用機制，并通過馬錢子堿對未成年小鼠子宮發(fā)育的影響，為其用于臨床治療腫瘤提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 馬錢子堿 (購自中國藥品生物制品檢定所)，人宮頸癌細胞系HeLa(購自中國醫(yī)學科學院細胞庫)，雌二醇 (Sigma公司)，DMEM培養(yǎng)基和胰酶 (美國Gibco)，新生小牛血清 (杭州四季青生物材料研究所)，3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽 ［MTT，3-(4，5-Dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide］(Sigama 公司)，乙二胺四乙酸 (EDTA)(華美公司)。SPF級昆明種(ICR)斷乳雌性小鼠60只，20日齡，由浙江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為 (22±2)℃，相對濕度60% ±20%，晝夜周期為12 h/12 h，自由飲水進食。

1.2 藥物處理 分別配制0.1 mol/L雌二醇和800 mg/L馬錢子堿的DMSO貯存液，4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。實驗時雌二醇用培養(yǎng)液稀釋依次梯度稀釋成 10－5、10－6、10－7、10－8、10－9、10－10、10－11mol/L 濃度，馬錢子堿依次梯度稀釋成終質量濃度50、100、200、400、800 mg/L。稱取0.05 g MTT溶于10 mL PBS中，終質量濃度為5 mg/mL，過濾除菌，避光保存于4℃冰箱，兩周內(nèi)有效。

1.3 HeLa細胞系培養(yǎng) 將HeLa細胞培養(yǎng)于含10%小牛血清的DMEM(1 L含NaHCO32 g；HEPES 3.57 g)中，置于37℃ 5%CO2的培養(yǎng)箱中。細胞均貼壁生長，每3 d傳代。傳代時移去舊培養(yǎng)液，以D-Hanks液洗滌2次，加入0.03%EDTA和0.125%胰酶消化2～5 min至細胞分散，離心 (1000 r/min，5 min)，培養(yǎng)液重新懸浮，接種于培養(yǎng)瓶，傳代率為1∶2或1∶3。

1.4 MTT比色實驗 培養(yǎng)HeLa細胞至對數(shù)期，胰酶消化用含5%小牛血清的DMEM將細胞制成5×104/mL的細胞懸液，以每孔200 μL接種于96孔板，37℃，5%CO2條件培養(yǎng)。24 h后取不同質量濃度的馬錢子堿加至細胞培養(yǎng)液中，實驗設陰性對照組和各種藥物濃度實驗組。每孔加入含5%小牛血清的DMEM配制的藥液10 μL，每種藥物濃度10個孔，12 h后采用倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化，并拍照記錄。加藥48 h后每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL)，37℃繼續(xù)孵育4 h后小心吸去上清液，然后每孔加入DMSO 200 μL，振蕩器振蕩10 min，充分混勻后于490 nm處測定各吸光度值，按公式計算細胞增殖抑制率。

1.5 子宮增質量實驗 將50只離乳ICR小鼠 (20日齡)按體質量()隨機分為5組，每組10只，分別為陰性對照組 (生理鹽水)，馬錢子堿質量濃度組共3組，在體濃度分別為2、4、8 mg/(kg·d)，分別以0.1、0.2、0.4 mg/mL的馬錢子堿溶液進行灌胃。陽性對照組雌二醇4 mg/(kg·d)。對上述5組小鼠同一時間稱量體質量后，進行灌胃。每天定時灌胃1次，連續(xù)3 d，給藥期間每天稱量體質量，根據(jù)體質量調整藥量。末次灌胃24 h后候頸椎脫臼法處死小鼠，迅速解剖并分離子宮周圍的脂肪和系膜組織，剪取子宮，用生理鹽水潤洗，濾紙同等時間 (30 s)吸干子宮表面血漬和子宮內(nèi)液，于萬分之一天平上稱量子宮濕質量 (采用雙盲法)并記錄有效數(shù)字，計算臟器系數(shù)(子宮濕體質量)，剪取分組標本制作病理切片。

1.6 統(tǒng)計學處理 采用spss18.0軟件統(tǒng)計包對各組數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，各項數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標準差()表示，采用雙樣本t檢驗進行組間分析，以P＜0.05為差異有顯著性。

2 結果

2.1 雌激素促進HeLa細胞增殖 采用MTT法測定光密度(OD)(490 nm)值，與正常對照組比較，雌二醇 (10－8～10－5mol/L)呈劑量依賴性地促進HeLa細胞的增值，低于10－9mol/L的雌二醇對HeLa細胞的吸光度值無顯著影響(見圖1)。

圖1 雌二醇劑量依賴性的促進HeLa細胞增殖

2.2 不同質量濃度馬錢子堿處理后的HeLa細胞形態(tài) 從圖1中可以看到，與對照組相比，馬錢子堿作用HeLa細胞后，出現(xiàn)可能的細胞凋亡現(xiàn)象，細胞皺縮變小、細胞間隙增加、懸浮細胞增多，隨質量濃度的增大此形態(tài)變化更加明顯。且在相同的視野下，細胞數(shù)也隨質量濃度的增大而減少 (見圖2)。

圖2 不同質量濃度的馬錢子堿處理HeLa細胞的形態(tài)變化結果 (×40)

2.3 不同質量濃度的馬錢子堿對HeLa細胞增殖的影響對照組及50、100、200、400、800 mg/L的馬錢子堿組對HeLa細胞作用48 h的增殖抑制率隨著作用質量濃度的增加而增加，呈明顯的劑量—效應關系 (P＜0.05)，OD值隨質量濃度和時間的增加而降低 (P＜0.05)。雌二醇顯著的促進HeLa細胞的增殖作用，而馬錢子堿對HeLa細胞有抑制作用，結果顯示不同質量濃度的馬錢子堿和10－8mol/L的雌二醇聯(lián)合作用于HeLa細胞48 h后，相比單獨的馬錢子堿組增殖抑制率均有所下降 (見表1)。

2.4 馬錢子堿對小鼠子宮增質量及子宮臟器系數(shù)的影響 將馬錢子堿作用之后幼雌ICR小鼠子宮濕質量及子宮臟器系數(shù)的變化做了統(tǒng)計，具體結果見表2。由表2可見，與對照組相比較，以4 mg/(kg·d)的雌二醇對幼雌ICR進行灌胃3 d可顯著促進小鼠的子宮增質量，與對照組相比具有顯著性差異 (P＜0.05)；馬錢子堿處理組，2、4、8 mg/(kg·d)劑量時均抑制未成年ICR小鼠的子宮增質量，與對照組相比具有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05)，而且隨著馬錢子堿質量濃度的增加，子宮增質量抑制效應明顯。

表1 不同質量濃度的馬錢子堿及聯(lián)合作用對HeLa細胞作用于48 h后的抑制率 (n=10)

表2 馬錢子堿作用后幼雌ICR子宮濕質量及子宮臟器系數(shù)的變化 ()

表2 馬錢子堿作用后幼雌ICR子宮濕質量及子宮臟器系數(shù)的變化 ()

注:與對照組比較，*P＜0.05。

實驗組 劑量/(mg·kg－1)平均子宮質量/g 臟器系數(shù)生理鹽水組 對照 0.04432±0.00478 0.0031±0.0004雌二醇組 4 0.07617±0.01384*0.0050±0.0008*馬錢子堿處理組 2 0.03454±0.00476*0.0025±0.0009*馬錢子堿處理組 4 0.02947±0.00398*0.0020±0.0004*馬錢子堿處理組 8 0.01962±0.00223*0.0014±0.0005*

3 討論

馬錢子作為散血熱、消腫、止痛的藥物，具有顯著的鎮(zhèn)痛、抗炎、抗腫瘤、興奮中樞等作用，用于風濕頑痹、麻木癱瘓、癰疽腫痛、小兒麻痹后遺癥和類風濕性關節(jié)痛等癥［16-17］。馬錢子堿是中藥馬錢子的主要有效成分且具有吲哚型的化學結構，這一類結構物質被認為具有潛在的抗腫瘤活性，如長春堿，粗榧生物堿等大多對腫瘤有生長抑制作用，并可誘導腫瘤細胞的凋亡［18-19］，因此從植物中尋找抗腫瘤藥物也成為極為重要的研究方向。體外研究發(fā)現(xiàn)，馬錢子堿可顯著抑制多種細胞的增殖［20］，而且對小鼠的實體瘤均表現(xiàn)出明顯的抑瘤作用，能有效抑制移植性肝癌模型荷瘤小鼠體內(nèi)腫瘤生長，宋愛英等［21］發(fā)現(xiàn)一定質量濃度的馬錢子水煎液的抑瘤率達到37.8%。馬錢子堿能引起HepG-2細胞的萎縮，阻礙細胞的形成，使DNA片段斷裂，最終導致HepG-2細胞凋亡［22］。余志艷等［23］發(fā)現(xiàn)馬錢子堿對乳腺癌細胞MDA-MB-231細胞具有增殖抑制作用，曲雷鳴等［24］研究表明，馬錢子堿對胃癌細胞株SGC7901的增殖有明顯的抑制作用。張蕻等［25］研究發(fā)現(xiàn)馬錢子堿高劑量組對小鼠移植性腫瘤H22的抑瘤率達到38.9%，證明了馬錢子堿對小鼠移植性腫瘤H22的生長有明顯的抑制作用。以上結果證明馬錢子堿是很有前途的抗腫瘤藥物，但目前關于馬錢子堿抗宮頸癌作用的研究很少，有待進一步深入探索。HeLa細胞作為常用的生物材料被廣泛應用于藥物抗腫瘤的藥理活性研究，本實驗通過體外細胞增殖實驗來研究馬錢子堿的抗腫瘤活性。本研究發(fā)現(xiàn)不同質量濃度的馬錢子堿溶液作用于HeLa細胞后會出現(xiàn)細胞凋亡現(xiàn)象，而且隨著藥物質量濃度的上升，細胞增殖抑制率逐漸升高。

之前的研究［26］發(fā)現(xiàn)宮頸癌細胞HeLa的發(fā)生發(fā)展與雌激素水平的變化具有很大關系，雌二醇通過促進細胞周期的轉化和細胞內(nèi)Ca2+的釋放，顯著的促進宮頸癌細胞的增殖作用，提示雌二醇在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過程中可能起著重要的調節(jié)作用，本研究也發(fā)現(xiàn)雌激素可以明顯促進HeLa細胞的增殖并具有質量濃度梯度依賴效應，并且不同質量濃度的馬錢子堿和的雌二醇聯(lián)合作用于HeLa細胞48 h后，相比單獨的馬錢子堿組增殖抑制率均有所下降，可以推測馬錢子堿對天然雌激素可能具有拮抗作用。另外，出生20 d左右的未成年雌性小鼠處于雌激素分泌最為旺盛的階段，主要表現(xiàn)為這個階段的子宮快速發(fā)育，本實驗通過研究這段時間馬錢子堿對未成年雌性小鼠子宮生長的影響可以判斷馬錢子堿的抗雌激素樣活性，實驗結果發(fā)現(xiàn)馬錢子堿抑制小鼠子宮發(fā)育，同樣可以推測馬錢子堿對天然雌激素可能具有拮抗作用，這也可能是馬錢子堿抑制HeLa細胞增殖的作用機制，相關的分子機制有待后續(xù)研究。

［1］魏 寧，張松偉.馬錢子的研究進展［J］.航空軍醫(yī)，2004，32(3):131.

［2］殷 武.馬錢子生物堿的鎮(zhèn)痛研究［D］.南京:南京中醫(yī)藥大學，2000.

［3］朱建偉，武繼彪，李成韶，等.馬錢子堿鎮(zhèn)痛作用及其藥效動力學研究［J］.中國中醫(yī)藥科技，2005，12(3):166-167.

［4］朱建偉，武繼彪，李成韶，等.復方馬錢子堿的鎮(zhèn)痛作用及其藥效動力學初步觀察［J］.中國中醫(yī)藥信息雜志，2005，12(9):36-37.

［5］趙紅衛(wèi)，翁世艾，朱燕娜，等.馬錢子堿對小鼠淋巴細胞功能的影響［J］.中國藥理學通報，1999，15(4):354-356.

［6］徐麗君，魏世超，陸付耳，等.馬錢子若干組分治療實驗性關節(jié)炎的比較研究［J］.同濟醫(yī)科大學學報，2001，30(6):564-565.

［7］Yin W，Wang TS，Yin FZ，et al.Analgesic and anti-inflammatory properties of brucine and brucine N-oxide extracted from seeds of Strychnos nux-vomica［J］.J Ethnopharmacol，2003，88(2-3):205-214.

［8］張 梅，李 平，陳朝暉，等.馬錢子堿對一氧化氮誘導軟骨細胞凋亡的影響［J］.中國臨床康復，2003，7(26):3554-3555.

［9］李明華，萬光瑞，朱 明，等.馬錢子堿對實驗性心律失常的影響［J］.新鄉(xiāng)醫(yī)學院學報，1997，14(2):101-103.

［10］李明華，張貴卿，趙德華.馬錢子堿對豚鼠心臟乳頭肌慢反應動作電位的影響［J］.中藥藥理與臨床，1997，13(4):19-21.

［11］周建英，卞慧敏，馬 騁，等.馬錢子堿和馬錢子堿氮氧化物抗血小板聚集及抗血栓形成作用的研究［J］.江蘇中醫(yī)，1998，19(4):41-43.

［12］鄧旭坤，蔡寶昌，殷 武.等.馬錢子堿對小鼠腫瘤的抑制作用［J］.中國天然藥物，2005，3(6):392-396.

［13］Deng X K，Yin F Z，Cai B C，et al.The apoptotic effect of brucine from the seed of Strychnos nux-vomica on human hepatoma cells is mediated via Bcl-2 and Ca2+involved mitochondrial pathway［J］.Toxicol Sci，2006，91(1):59-69.

［14］鄧旭坤，蔡寶昌，呂曉宇，等.馬錢子堿及其脂質體對移植性荷瘤小鼠抗腫瘤作用的對比研究［J］.中草藥，2006，37(3):389-393.

［15］朱曉武.17β雌二醇對宮頸癌細胞株生物學的影響和上皮性卵巢腫瘤微淋巴管內(nèi)皮細胞的體外培養(yǎng)［D］.武漢:華中科技大學，2010.

［16］鄧旭坤，蔡寶昌.馬錢子抗腫瘤藥理研究及臨床應用進展［C］//21世紀中醫(yī)藥-2004江蘇省博士研究生學術論壇文集，南京:南京中醫(yī)藥大學，2004:168-173.

［17］羅 剛，吳世成.馬錢子藥理學及毒理學研究進展［J］.科技信息，2007(31):351-352.

［18］遲德彪.鉤吻素子體外抑制人結腸腺癌細胞生長并誘導其凋亡及其機制的探討［D］.廣州:第一軍醫(yī)大學，2000，25-261.

［19］程 磊，周秀佳.植物生物堿抗腫瘤機制［J］.中草藥，2004，35(2):216-221.

［20］Lazareno S，Gharagozloo P，Kuonen D，et al.Subtype-selective positive cooperative interactions between brucine analogues and acetylcholine at muscarinic receptors:radioligand binding studies［J］.Mol Pharmacol，1998，53(3):573-589.

［21］宋愛英，張國烈，劉松江，等.馬錢子抗腫瘤作用的實驗研究［J］.中國中醫(yī)藥科技，2004，11(6):363.

［22］鄧旭坤，蔡寶昌，殷 武，等.Brucine對Heps荷瘤小鼠的抗腫瘤作用和毒性的研究［J］.中國藥理學通報，2006，22(1):35-39.

［23］余志艷，李 平.馬錢子堿對乳腺癌細胞MDA.MB.231作用的實驗研究［J］.安徽醫(yī)藥，2008，12(9)，779-783.

［24］曲雷鳴，龔 偉.復方郁金片抗腫瘤的實驗研究［J］.遼寧中醫(yī)藥大學學報，2007，9(3):96-97.

［25］張 蕻，李燕玲，任連生，等.馬錢子天南星對小鼠移植性腫瘤的抑瘤作用［J］.中國藥物與臨床，2005，5(4):272-273.

［26］鄒自英，袁成良，何亞平，等.雌激素對宮頸癌HeLa細胞增殖的影響及ERB的表達［J］.四川醫(yī)學，2003，12(24):1288-1291.