楊套偉，饒志明，張顯，徐美娟，許正宏

1 江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗室，江蘇 無錫 214122

2 江南大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 無錫 214122

生物能源作為可再生能源，有望減少能源供給對石油的依賴程度[1]。2,3-丁二醇作為一種非常重要的生物基四碳平臺化合物，廣泛應(yīng)用于化工、能源、燃料等多個領(lǐng)域[2]。近年來用糖質(zhì)原料發(fā)酵生產(chǎn) 2,3-丁二醇取得了較好的實(shí)驗室研究結(jié)果[2-3]。然而從2,3-丁二醇的應(yīng)用前景及未來發(fā)展趨勢看，開發(fā)以廉價的非糧糖質(zhì)為原料發(fā)酵生產(chǎn) 2,3-丁二醇具有很好的發(fā)展前景[3]。利用油脂生產(chǎn)生物柴油的過程中，約產(chǎn)生 10%的副產(chǎn)物甘油[4]。將這些粗甘油轉(zhuǎn)化為更有附加價值的產(chǎn)品，有利于降低這些副產(chǎn)物的處理成本[4]。肺炎克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniae能利用甘油生產(chǎn) 2,3-丁二醇[5]，但產(chǎn)生大量副產(chǎn)物1,3-丙二醇，這將增加產(chǎn)物后續(xù)分離純化的成本，且該菌種具有潛在致病性，不符合工業(yè)化安全生產(chǎn)的要求[2]。解淀粉芽胞桿菌Bacillus amyloliquefaciens是被美國FDA認(rèn)可的安全菌株[6]。因此，利用安全菌株B. amyloliquefaciens發(fā)酵粗甘油生產(chǎn)2,3-丁二醇具有良好應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 菌種

B. amyloliquefaciens B10-127，由本研究室篩選并保藏[7]。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基[7](g/L)：葡萄糖20，胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10，自然pH值。

發(fā)酵培養(yǎng)基[7](g/L)：粗甘油100，玉米漿 20，酵母膏 5，檸檬酸銨 3，K2HPO44，檸檬酸 5，MgSO40.2，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01，初始 pH 6.0。

粗甘油購自諸暨興綠油脂有限公司，主要成分(W/W)：88%甘油, 0.5%灰分, 0.2%甲醇, 10%水。

1.2.2 培養(yǎng)方法

菌種活化：將200 μL冷凍保藏的菌液接種于10 mL 種子培養(yǎng)基中，37 ℃、160 r/min 培養(yǎng) 16 h。

搖瓶發(fā)酵實(shí)驗：將充分活化的種子液按 4%(V/V)接種量接種到含有 50 mL液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，37 ℃、160 r/min搖床培養(yǎng)。

發(fā)酵罐發(fā)酵實(shí)驗：5 L發(fā)酵罐，裝液量2.5 L，接種量4% (V/V)；發(fā)酵條件：通氣量0.33 vvm，發(fā)酵溫度 37 ℃；流加發(fā)酵時，粗甘油水溶液補(bǔ)料液：500 g/600 mL; 采用脈沖流加發(fā)酵，每次流加 1/4體積的母液，甘油消耗完后即刻停止發(fā)酵。

1.2.3 分析方法

菌體量以干重(DCW)表示，產(chǎn)物和底物濃度檢測使用高效液相色譜法，具體方法見文獻(xiàn)[5]。

2 結(jié)果與分析

2.1 粗甘油對2,3-丁二醇發(fā)酵的影響

以純甘油作為對照，考察了粗甘油是否適合作為2,3-丁二醇發(fā)酵的直接底物。初始甘油含量為40 g/L，結(jié)果如圖1所示，發(fā)酵60 h后，菌株利用粗甘油和純甘油的效率基本一樣，分別消耗甘油36.7 g/L和38.6 g/L；另外菌體生長情況基本相同，并且2,3-丁二醇產(chǎn)量都在13 g/L左右。由此可知，B. amyloliquefaciens能直接以粗甘油為底物發(fā)酵生產(chǎn)2,3-丁二醇。

圖1 不同類型的甘油對2,3-丁二醇發(fā)酵的影響Fig. 1 Effects of different types of glycerol on 2,3-BD production.

2.2 pH控制策略對2,3-丁二醇發(fā)酵的影響

2,3-丁二醇的主要生理功能是應(yīng)對有機(jī)酸抑制和維持胞內(nèi)氧化還原平衡[2]。設(shè)定初始 pH為5.5～7.5，考察了發(fā)酵過程中 pH控制與否對 2,3-丁二醇發(fā)酵的影響，結(jié)果如表 1所示，發(fā)酵過程中不控制pH (初始pH為6.5)更有利于菌體生長和2,3-丁二醇的合成，這和Biebl等[9]的研究結(jié)果相一致。此時，產(chǎn)物合成與pH變化曲線如圖2所示，發(fā)酵前期pH迅速下降至5.5左右，隨后pH上升至 6.5附近并呈現(xiàn)上下波動現(xiàn)象。Petrov和Petrova[5]在考察pH對K. pneumoniae發(fā)酵甘油合成2,3-丁二醇的影響時也發(fā)現(xiàn)類似的現(xiàn)象。Petrov和 Petrova解釋說，2,3-丁二醇是受有機(jī)酸誘導(dǎo)而合成的，在初始發(fā)酵階段，菌株先合成大量有機(jī)酸，從而導(dǎo)致發(fā)酵環(huán)境中pH值大幅降低，細(xì)胞因酸性環(huán)境刺激而快速轉(zhuǎn)向2,3-丁二醇的合成，乙酸合成暫時中止，pH因而逐漸升高；pH升高又刺激了乙酸的合成；隨后2,3-丁二醇和乙酸合成效率交替升高，從而導(dǎo)致pH值的上下波動。所以，發(fā)酵過程中不控制pH更能促進(jìn)2,3-丁二醇的合成。

2.3 溶氧分階段調(diào)控2,3-丁二醇發(fā)酵過程

圖2 pH與產(chǎn)物合成變化曲線Fig. 2 Time profiles of pH changes and products formation under pH non-controlled.

表1 pH對2,3-丁二醇發(fā)酵的影響Table 1 Effects of pH on 2,3-BD production

據(jù)文獻(xiàn)報道[2-3,10]，溶氧水平對于提高 2,3-丁二醇的發(fā)酵效率和降低乙偶姻等副產(chǎn)物的積累具有重要影響。根據(jù) B. amyloliquefaciens的生理特征，我們提出了一種行之有效的溶氧控制策略。

2.3.1 不同攪拌轉(zhuǎn)速下菌株B10-127 發(fā)酵生產(chǎn)2,3-丁二醇的動力學(xué)特征

比速率是一個相對速度，它與生物量有密切的關(guān)系，比速率用方程組(1)來定義，單位為h–1。m為生長的比速率，qs為底物消耗的比速率，qp為產(chǎn)物形成的比速率。根據(jù)m、qs和qp的定義式：

當(dāng)時間間隔很小時，可以近似用(2)式直接計算得到m、qs和 qp

利用Orign 8.0作圖軟件，對圖3(A～C)中的數(shù)據(jù)進(jìn)行插值計算(時間間隔為 0.1 h)，求解得到發(fā)酵過程不同時刻的m、qs和qp；經(jīng)平滑處理，得到不同攪拌速度下動力學(xué)參數(shù)曲線(圖 3D～F)。綜合分析圖3A～F可以發(fā)現(xiàn)：菌株在不同階段對氧的需求并不相同，1)在低攪拌轉(zhuǎn)速下菌株的延滯期(0～4 h)較短；2)在較高的攪拌轉(zhuǎn)速下(400 r/min)，細(xì)胞在發(fā)酵前期(4～18 h)具有較高的m、qs和qp，即此階段，高轉(zhuǎn)速更能促進(jìn)菌體的生長和底物消耗；3)而18 h以后，在400 r/min條件下(圖3D)，菌體m逐漸變?yōu)樨?fù)值，此時菌體衰亡速率大于生長速率，菌體量增長緩慢，qp逐漸降至負(fù)值，主要原因是菌體衰亡導(dǎo)致發(fā)酵液中溶氧升高，2,3-丁二醇開始逆向合成副產(chǎn)物乙偶姻[2]。而在350 r/min條件下，仍能維持較高的m和qp。

2.3.2 分階段供氧控制模式的提出和實(shí)驗驗證

圖3 不同攪拌轉(zhuǎn)速下的2,3-丁二醇發(fā)酵過程動力學(xué)曲線Fig. 3 Comparison of kinetic parameters in 2,3-BD fermentation at different agitation speed.

表2 攪拌轉(zhuǎn)速控制策略對2,3-丁二醇發(fā)酵的影響Table 2 2,3-BD production at different agitation speed

圖4 分階段控制轉(zhuǎn)速條件下發(fā)酵過程曲線Fig. 4 Time profiles of 2, 3-BD fermentation using a three-stage agitation speed control strategy.

根據(jù)上述分析結(jié)果，我們提出了一種三階段控制轉(zhuǎn)速的模式 (圖4)，即0～4 h控制轉(zhuǎn)速300 r/min，使菌體快速開始生長，縮短延滯期；在4～18 h，控制轉(zhuǎn)速400 r/min，使其保持較高的m、qs和qp；18 h之后，轉(zhuǎn)速將至 350 r/min，防止細(xì)胞過早衰老，保持菌體的持續(xù)生長和較高代謝速率。由表 2 可知，采用分階段供氧控制模式，既能夠保持較高的產(chǎn)率(0.40 g/g)，又能保持較高的甘油消耗速度(2.78 g/(L·h))，發(fā)酵 36 h，2,3-丁二醇產(chǎn)量就達(dá)到了38.1 g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度(1.1 g/(L·h))比恒定轉(zhuǎn)速 300、350和 400 r/min時分別提高了 130%、63.1%和89.3%，副產(chǎn)物乙偶姻積累量分別降低了48.4%、45.5%和 73.0%。因此，該轉(zhuǎn)速控制模式有利于提高 B. amyloliquefaciens發(fā)酵粗甘油生產(chǎn)2,3-丁二醇的產(chǎn)量和效率。

2.4 批式流加發(fā)酵生產(chǎn)2,3-丁二醇

補(bǔ)料流加發(fā)酵結(jié)果如圖5所示，發(fā)酵72 h，2,3-丁二醇產(chǎn)量達(dá)到 71.2 g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度達(dá)到0.99 g/(L·h)。Petrov 和 Petrova[11]利用 K. pneumoniae通過補(bǔ)料流加發(fā)酵，2,3-丁二醇產(chǎn)量達(dá)到70 g/L，這是此前報道的利用甘油發(fā)酵生產(chǎn) 2,3-丁二醇的最高產(chǎn)量，但其發(fā)酵周期長達(dá)160 h，生產(chǎn)強(qiáng)度僅為0.44 g/(L·h)。因此，我們的研究結(jié)果可以和目前報道的最高產(chǎn)量相媲美。

圖5 粗甘油批式流加發(fā)酵生產(chǎn) 2,3-丁二醇過程曲線Fig. 5 Fed-batch fermentation profiles using a pulse feeding batch strategy.

3 結(jié)論

粗甘油可以作為 B. amyloliquefaciens合成2,3-丁二醇的直接底物；發(fā)酵過程中菌體通過自身對環(huán)境 pH的反饋調(diào)節(jié)更能促進(jìn) 2,3-丁二醇的合成；通過三階段轉(zhuǎn)速調(diào)控策略，促進(jìn)目標(biāo)產(chǎn)物2,3-丁二醇的合成，減少副產(chǎn)物乙偶姻的積累。通過補(bǔ)料流加實(shí)驗，2,3-丁二醇產(chǎn)量達(dá)到71.2 g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度為 0.99 g/(L·h)。本文利用未經(jīng)預(yù)處理的生物柴油副產(chǎn)物粗甘油為底物，為粗甘油的深加工技術(shù)開發(fā)提供了理論基礎(chǔ)。

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