蘭翀，任麗娜，吳敏，劉思國，劉國輝，徐旭俊，陳建泉，馬恒東，成國祥

1 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物遺傳育種研究所，四川 雅安 625014

2 上海轉(zhuǎn)基因動物育種與制藥工程技術(shù)研究中心 上海杰隆生物工程股份有限公司，上海 201210

轉(zhuǎn)基因技術(shù)是當今基因工程領(lǐng)域中的重要應(yīng)用性新技術(shù)。在植物新品種培育方面，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)已獲得了許多植物新品種，顯著改善了農(nóng)藝性狀[1]。但在家畜新品種培育方面，轉(zhuǎn)基因技術(shù)的成功案例僅局限在牛、羊上的幾例[2]，還需要進行完善和優(yōu)化。目前，轉(zhuǎn)基因家畜主要是通過體細胞遺傳修飾聯(lián)合體細胞克隆技術(shù)獲得的[3]。在細胞遺傳修飾期間不可避免的需要用篩選標記基因 (Selectable marker genes，SMGs)來富集轉(zhuǎn)基因成功的細胞，之后不僅不再需要SMGs，還可能因其整合位點毗鄰目的基因而影響目的蛋白的表達[4]。此外，我國的轉(zhuǎn)基因安全評價政策將SMGs視同目的基因，要求進行復(fù)雜的安全評價[5]。

由上可見，刪除SMGs不僅可以優(yōu)化轉(zhuǎn)基因的表達，還可以簡化轉(zhuǎn)基因動物的安全評價過程，加快轉(zhuǎn)基因動物新品種的培育和產(chǎn)業(yè)化進程。之前，我們曾利用 Cre/LoxP系統(tǒng)成功刪除了人溶菌酶轉(zhuǎn)基因山羊體內(nèi)的 SMGs[6]。但該過程需要兩輪細胞遺傳修飾和體細胞克隆過程，周期長，獲得SMGs刪除的轉(zhuǎn)基因山羊至少需要2年才能完成。本文研究了在體細胞克隆前后兩個時段內(nèi)，利用 Cre/LoxP系統(tǒng)刪除標記基因的可行性，比較了蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)和質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染兩種 CRE蛋白導(dǎo)入方式的刪除效率，獲得了刪除轉(zhuǎn)基因山羊體內(nèi)SMGs的時機和方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人溶菌酶轉(zhuǎn)基因山羊(Human lysozyme transgenic goats，hLYZ-G)人溶菌酶基因與SMGs緊密連鎖，整合于山羊的5號染色體上，排列順序為 5'-[LoxP→-neo-TK-LoxP→]-[人溶菌酶表達框架]-3'[6]；sCT-G，hLYZ-G 為上海杰隆生物工程股份有限公司/上海轉(zhuǎn)基因研究中心研制。SMGs載體質(zhì)粒為 pGH4，實驗室自存，內(nèi)含有neoR和TK兩種篩選基因以及LoxP位點，排列方式為：5'-LoxP→-neo-TK-LoxP→-3'。表達Cre蛋白質(zhì)的質(zhì)粒pBS185 (Addgene)。GMEM完全培養(yǎng)液：添加有10% FBS、青鏈霉素和非必需氨基酸的GMEM培養(yǎng)液 (GIBCO)；GMEM篩選培養(yǎng)液：含有1 000 μg/mL G418的GMEM完全培養(yǎng)液。

1.2 TAT-Cre酶的制備、活性測定與細胞轉(zhuǎn)染

TAT-Cre酶的表達與純化方法參照文獻[6]進行。TAT-Cre酶的活性測定：在酶切反應(yīng)液(33 mmol/L NaCl, 50 mmol/L Tris-HCl (pH 7.5),10 mmol/L MgCl2)中加入1 μg的pGH4質(zhì)粒和0.1 μg的TAT-Cre酶，37 ℃溫育4 h，瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切情況。

TAT-Cre蛋白轉(zhuǎn)染按文獻[6]進行，簡述為：細胞生長至 90%匯合度時，PBS洗 3次，加入2 μmol/L 的 TAT-Cre酶，37 ℃、5% CO2培養(yǎng) 3 h后，PBS洗3次，換GMEM完全培養(yǎng)液培養(yǎng)1 d，之后按 100個細胞/皿傳至 100 mm細胞培養(yǎng)皿中，添加GMEM選擇培養(yǎng)液培養(yǎng)10 d后，利用克隆環(huán)法挑取單克隆細胞并進行擴大培養(yǎng)。

1.3 體細胞克隆山羊的制備和山羊成纖維細胞的分離

人工合成鮭魚降鈣素 (Salcalcitonin，sCT)基因(5'-atgaaggtcctcatccttgcctgtctggtggctctggccattgca caccaccaccaccaccacagaagaagaagaaagtgcagcaacctgag cacctgcgtgctgggcaagctgagccaggagctgcacaagctgcaga cctaccccgtgaccaacaccggcagcggcacccccggctaa-3')，將之裝入牛β-乳球蛋白啟動子調(diào)控的乳腺特異表達載體pBLG內(nèi)，成為鮭魚降鈣素乳腺特異表達載體pBLG-sct。將pBLG-sct與SMGs載體pGH4共轉(zhuǎn)染山羊胎兒成纖維細胞，經(jīng)篩選和鑒定獲得sCT基因整合細胞株并制備出體細胞克隆山羊，具體方法參見文獻[9]。

按照文獻[7]提供的方法分離鮭魚降鈣素轉(zhuǎn)基因山羊 (Salcalcitonin transgenic goats，sCT-G)和人溶菌酶轉(zhuǎn)基因山羊的耳皮成纖維細胞，分別命名為sCT-G-EFC和hLYZ-G-EFC。按照文獻[8]分離正常山羊的 32 d胎兒成纖維細胞(Fetal fibroblasts of normal goat，G-FF)。

1.4 TAT-Cre蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞

細胞在培養(yǎng)皿中生長至 90%匯合時棄去培養(yǎng)液，PBS清洗細胞，加入OPTI-MEM培養(yǎng)液(GIBCO)稀釋的 TAT-Cre酶，使酶終濃度為2 μmol/L，37 ℃、5% CO2培養(yǎng) 3 h后，PBS清洗細胞，換GMEM完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，24 h后按100個細胞傳至 1個 100 mm細胞培養(yǎng)皿的密度分板，添加GMEM選擇培養(yǎng)液培養(yǎng)10 d，利用克隆環(huán)法挑取單克隆細胞，按96孔-48孔-24孔-12孔-6孔的順序進行擴大培養(yǎng)。

1.5 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染細胞

按 照 Lipofectamine 2000 Transfection Reagent (Invitrogen 11668)的說明進行轉(zhuǎn)染。簡述為：在24孔細胞板中，細胞生長至90%匯合時，用 OPTI-MEM培養(yǎng)液稀釋 pBS185質(zhì)粒至10 μg/mL，每 100 μL DNA 中加入 1 μL PLUS 和3 μL脂質(zhì)體，混勻后獲得DNA-lipid復(fù)合物；在24孔細胞板中加入DNA-lipid復(fù)合物100 μL/孔，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)，6 h后換GMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，12 h后按 100個細胞/皿的密度傳至100 mm細胞培養(yǎng)皿中，按1.4方法進行單克隆細胞的篩選和培養(yǎng)。

1.6 PCR檢測

按照細胞基因組提取試劑盒 (TIANGEN Cat No. DP304-03)說明提取細胞基因組，溶于50 μL超純水中，4 ℃保存。利用表1中的引物檢測neoR、β-actin、sCT、cre四種基因進行PCR擴增，條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，退火溫度為表1列示，擴增30個循環(huán)，LA Taq酶為TaKaRa公司產(chǎn)品。

表1 PCR檢測檢測所需引物序列Table 1 Sequences of detection primers for PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 TAT-Cre的純化、濃度與活性測定結(jié)果

大腸桿菌中表達純化的TAT-Cre酶有良好的純度生物學(xué)活性，可有效地將pGH4中3.2 kb的篩選基因切出 (圖1A和圖1B)。經(jīng)TAT-Cre轉(zhuǎn)染的人溶菌酶轉(zhuǎn)基因山羊成纖維細胞失去了對G418的抵抗能力，篩選培養(yǎng)4 d后出現(xiàn)了大面積的死亡 (圖 1C)，說明所純化的 TAT-Cre具有穿透細胞膜，進入細胞發(fā)揮作用的功能。

圖1 TAT-Cre酶的純化與活性檢測Fig. 1 Purification and activity detection of TAT-CRE enzyme. (A)Identification of TAT-Cre through SDS-PAGE. 1:TAT-Cre; M: protein marker. (B)The activity detection of TAT-Cre in vitro. M: DNA marker; 1–3: the vector digested with TAT-Cre; 2: negative control. (C)TAT-Cre-treated cells with resistance of G418. (D)Normal cells with resistance of G418.

2.2 體細胞克隆前刪除標記基因

利用TAT-Cre處理sCT-G的制備過程中得到的7個單克隆細胞株。隨后在處理完的7株細胞中各取了100個細胞鋪板于100 mm培養(yǎng)皿，10 d后挑出了57個單克隆。經(jīng)檢測，這57株細胞中有25株細胞中的neoR基因被刪除 (圖2)，刪除效率達到43.9%。這證明TAT-Cre在第一次細胞轉(zhuǎn)染后即可有效刪除與目的基因共整合的標記基因。但這一過程經(jīng)歷了連續(xù)兩次低密度傳代和單細胞克隆的挑取，所獲得單細胞克隆嚴重老化，無法進一步傳代，最終未獲得可供克隆用的sCT轉(zhuǎn)基因整合的單克隆細胞。

本研究嘗試利用pBS185瞬間表達法刪除首次轉(zhuǎn)基因克隆內(nèi)的標記基因，但因細胞老化嚴重，最終未獲得可供檢測用的sCT轉(zhuǎn)基因整合的單克隆細胞。

圖2 TAT-Cre酶對體細胞克隆前標記基因的刪除Fig. 2 Deletion of TAT-Cre on somatic cell marker gene. 1–58: cell clones treated by TAT-Cre; c1-c8:positive cell without TAT-Cre selected by G418.

2.3 體細胞克隆后刪除標記基因

用TAT-Cre酶處理hLYZ-G-EFC，挑取了共114個單克隆細胞株，neoR基因檢測表明，其中有83個克隆細胞的neoR被成功刪除 (圖3)，刪除效率為：83/114=72.81%。

利用pBS185質(zhì)粒瞬間表達法檢測SMGs的刪除效率。用 pBS185質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染hLYZ-G-EFC，共挑取了 64個單克隆細胞株，G418殺傷試驗表明，其中5個克隆株細胞被殺死，刪除效率為7.81% (5/64)。

為進一步驗證TAT-Cre蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)法刪除標記基因的適用性。用TAT-Cre處理SCT-G-EFC，共挑取了16個克隆，經(jīng)檢測其中有13株細胞克隆中的標記基因被成功刪除 (圖 4)，效率 46.2%(6/13)。這表明，TAT-Cre介導(dǎo)標記基因刪除是一種廣適性的方法。

圖3 TAT-Cre介導(dǎo)的克隆羊體細胞中 neoR基因的刪除Fig. 3 Deletion of neoR gene in selected clone mediated by TAT-Cre. 1–114: selected clone; C1:positive control; C2, C3: blank.

圖4 sCT轉(zhuǎn)基因山羊體細胞內(nèi)標記基因的刪除Fig.4 Deletion of marker gene in sCT transgenic goat’s somatic cells. 1–13: selected sCT transgenic fibroblast cell clone; 14: blank; 15: plasmid control.

2.4 Cre質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染方法的載體摻入率

pBS185瞬時轉(zhuǎn)染的方法也可以對SMGS有效刪除，但所獲得的部分克隆中難免整合有Cre表達質(zhì)粒的序列。以該法獲得9株刪除了標記基因的ChLYZ-G-EFC，檢測細胞中來自pBS185的Cre基因：有3株細胞整合了Cre基因 (圖5)，摻入率為33.3%。

圖5 pBS185質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染中的質(zhì)粒序列摻入情況Fig. 5 Condition of plasmid pBS185 sequences enter cell in transient transfection. 1–9: sCT transgenic integrated positive monoclonal cell strains; 2, 3 and 8:pBS185 plasmid sequences exist in clones.

3 討論

SMGs刪除在轉(zhuǎn)基因植物中已較為成熟，主要有轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)基因再定位系統(tǒng)、共轉(zhuǎn)化和遺傳分離系統(tǒng)、重組酶介導(dǎo)的基因剪切系統(tǒng)和依賴染色體內(nèi)同源重組的 SMGs切除系統(tǒng)等 4種技術(shù)[10]。在轉(zhuǎn)基因動物中，SMGs刪除多在ES細胞相關(guān)的研究[11]，所用技術(shù)以同源重組和重組酶系統(tǒng)為主[12]。在大家畜上，因目前還未能建立有效的家畜ES細胞系，利用壽命有限的體細胞難以實現(xiàn)多次遺傳修飾。本研究嘗試了在體外對山羊胎兒成纖維細胞進行兩次遺傳修飾，均因細胞老化問題未能獲得可供體細胞克隆用的 SMGs刪除的轉(zhuǎn)基因細胞株。由此，對SMGs的刪除不得不推遲到體細胞克隆之后。在小鼠上，有通過顯微注射方法將Cre表達質(zhì)粒注射入轉(zhuǎn)基因小鼠受精卵內(nèi)，通過Cre酶的瞬時表達來刪除兩側(cè)裝接loxP的DNA序列的報道[13-14]，但該方法低效且存在注射入的質(zhì)粒整合入基因組內(nèi)的風(fēng)險，不適合轉(zhuǎn)基因家畜。Kaartinen等報道通過攜帶表達Cre的腺病毒感染 16-細胞期桑椹胚來刪除SMGs[15]，顯然病毒載體的安全性問題也不適合用于以產(chǎn)業(yè)化為目的的家畜轉(zhuǎn)基因。目前在家畜上成功刪除 SMGs的報道均是在獲得轉(zhuǎn)基因動物或轉(zhuǎn)基因動物的胚胎后，再在分離出的轉(zhuǎn)基因家畜成體細胞上進行的。Wang等在轉(zhuǎn)基因牛成纖維細胞中瞬時轉(zhuǎn)染Cre和eGFP共表達載體，以eGFP的表達指示Cre的表達，通過FACS技術(shù)篩選出了表達Cre的細胞，其中有80%的細胞內(nèi)SMGs被刪除[16]。Kuroiwa等通過在轉(zhuǎn)基因牛成纖維細胞中轉(zhuǎn)染 Cre瞬時表達質(zhì)粒獲得了無SMGs的免疫球蛋白μ鏈和PRNP雙基因敲除的牛[17]。

但是上述通過轉(zhuǎn)染Cre表達質(zhì)粒成功刪除轉(zhuǎn)基因家畜體內(nèi)SMGs的研究均指出：Cre表達質(zhì)粒有較高的摻入率，Wang等報道為 1/3[16]，Kuroiwa等報道為 4/5[17]，本研究用同樣方法證明其摻入率為 1/3。為了優(yōu)化這一過程，本研究中使用了TAT-Cre蛋白直接轉(zhuǎn)染細胞方法克服了質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的不足。TAT-Cre是在野生型Cre蛋白的N端引入了HIV的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域 (Protein transduction domains)——TAT序列形成的，它可以直接穿透細胞膜進入細胞內(nèi)發(fā)揮功能，目前TAT-Cre已經(jīng)得到了許多成功應(yīng)用[18-19]。利用該方法獲得的刪除了 SMGs的羊成纖維細胞可用于體細胞克隆獲得轉(zhuǎn)基因山羊[6]。

Nolden研究顯示血清的存在能夠抑制TAT-Cre的細胞穿透活性，并表明TAT-Cre與胚胎干細胞孵育3 h可產(chǎn)生最大的重組效率[20]。本研究嘗試了用 100、200、300、400、500 的 TAT-Cre酶對山羊成纖維孵育3 h，發(fā)現(xiàn)高于300 μg/mL時，TAT-Cre會對細胞產(chǎn)生毒害作用，最終確定了TAT-Cre的作用濃度為200 μg/mL (結(jié)果未給出)。最終結(jié)果表明，這一條件可以獲得較高的刪除效率 (表2)。

表2比較了刪除SMGs的不同時機和方法的優(yōu)缺點。從表中可見，盡管在體細胞克隆前刪除SMGs最經(jīng)濟，但連續(xù)兩次遺傳修飾會導(dǎo)致細胞發(fā)生嚴重的老化，無法繼續(xù)完成體細胞克隆工作。在轉(zhuǎn)基因山羊獲得后再進行SMGs刪除不存在上述問題，但缺點是試驗周期長、耗資大。因TAT-CRE轉(zhuǎn)導(dǎo)方法對細胞損傷小，且不會引入新的外源基因，是一種較佳的SMGs刪除手段。

表2 刪除標記基因的不同時機和方法比較Table 2 Comparison of deleting marker gene between different times and methods

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