金利群，吳叢偉，柳志強，鄭裕國，沈寅初

(浙江工業(yè)大學(xué)生物工程研究所，浙江 杭州，310014)

腈水解酶(Nitrilase，EC 3.5.5.1)是一種重要的腈轉(zhuǎn)化酶，能一步催化腈化合物合成相應(yīng)的羧酸，因其反應(yīng)條件溫和，污染少，且產(chǎn)物易于處理，被廣泛應(yīng)用于精細化學(xué)品和原料藥的生產(chǎn)［1－3］。蛋氨酸又名甲硫氨酸，是必需氨基酸中唯一含硫的氨基酸，可被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化妝品和飼料等領(lǐng)域，尤其以飼料添加劑的用量最大［4］。蛋氨酸作為飼料中必不可少的一種添加劑，在短期內(nèi)可以迅速提高瘦肉量縮短培養(yǎng)周期，使其節(jié)省40%左右的飼料;在化妝品領(lǐng)域，蛋氨酸用于體內(nèi)甲基的轉(zhuǎn)移，可以有效延緩衰老。隨著全球人口的不斷增長和生活水平的提高，蛋氨酸的需求一直處于快速增長的態(tài)勢［5］。目前世界上主要的蛋氨酸生產(chǎn)公司多采用濃H2SO4且在高溫和高壓下水解2-氨基-4-甲硫基丁腈最終獲得蛋氨酸，反應(yīng)條件劇烈、對設(shè)備腐蝕性大，同時產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物、環(huán)境污染嚴(yán)重。

近年來，蛋氨酸的腈酶催化生產(chǎn)吸引了世界主要蛋氨酸生產(chǎn)公司的關(guān)注，相繼開發(fā)腈轉(zhuǎn)化酶催化工藝。如曹達公司和羅納-普朗克公司先后研究了腈水解酶催化制備蛋氨酸及其衍生物的工藝，但其腈水解酶活力低，僅為100 U/gDCW，蛋氨酸產(chǎn)量不高，難以實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)［6－8］。本課題組在腈轉(zhuǎn)化酶生物催化領(lǐng)域已作了多年的研究和探索，通過基因工程方法構(gòu)建了重組大腸桿菌E. coli BL21 (DE3)/pET-28b-NIT，能有效的催化水解2-氨基-4-甲硫基丁腈合成蛋氨酸(圖1)，但該重組菌培養(yǎng)過程菌體量較低，影響催化劑的有效制備。對于以生產(chǎn)外源蛋白為目的的重組菌發(fā)酵，希望在發(fā)酵過程中獲得盡可能多的目的蛋白，實現(xiàn)重組菌的高密度培養(yǎng)。分批補料培養(yǎng)是實現(xiàn)重組大腸桿菌高密度高表達培養(yǎng)的最常用和最有效的方法［9］。選擇合適的補料培養(yǎng)基和流加策略，可創(chuàng)造出既適合菌體生長又適合酶表達的培養(yǎng)環(huán)境條件，常常成為實現(xiàn)高密度培養(yǎng)和高表達的關(guān)鍵因素［10－12］。

圖1 腈水解酶制備蛋氨酸工藝Fig.1 Synthesis of methionine by nitrilase

為此，本論文在前期培養(yǎng)基優(yōu)化的基礎(chǔ)上，對重組菌E. coli BL21 (DE3)/pET-28b-NIT 在5 L 發(fā)酵罐上的補料分批培養(yǎng)工藝進行了研究，使該菌在保持酶活的同時能夠大量且快速生長，為蛋氨酸的生物催化法工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗菌種

重組大腸桿菌E. coli BL21 (DE3)/pET-28b-NIT，目的基因源于 Acidovorax facilis (GenBank:444267)，由本實驗室構(gòu)建。

1.2 實驗裝置

采用RALF plus 5 L 發(fā)酵罐，瑞士Bioengineering公司。

1.3 培養(yǎng)基

1.3.1 種子培養(yǎng)基( g/L)

蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 5，pH 7.0。

1.3.2 初始發(fā)酵培養(yǎng)基( g/L)

蛋白胨12，酵母粉8，NaCl 8，pH 7.0。

1.3.3 碳源補料培養(yǎng)基

葡萄糖60 g/L，配置成一定體積的溶液，每次補加50 mL。

1.3.4 氮源補料培養(yǎng)基

補料I 含蛋白胨12 g，酵母粉8 g，定容至200 mL(分4 次補加，每次50 mL);補料II 含蛋白胨24 g，酵母粉16 g，定容至200 mL(分4 次補加，每次50 mL)。

1.4 實驗方法

1.4.1 種子制備

從活化斜面接種1 環(huán)菌體至種子培養(yǎng)基中，每100 mL 培養(yǎng)基加入100 μL 的Kanamycin(0.05 g/mL)。在37 ℃，150 r/min 的搖床上培養(yǎng)12 h。

1.4.2 5 L 發(fā)酵罐初始培養(yǎng)條件

按3%的接種量將種子液接入裝有2.5 L 基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的5 L 發(fā)酵罐中，培養(yǎng)溫度37 ℃，攪拌速率400 r/min，通氣量1.5 L/min，測定發(fā)酵液中的溶氧(%);培養(yǎng)過程中取樣檢測發(fā)酵液OD 值，當(dāng)OD600=0.6 ～0.8 之間時加入誘導(dǎo)劑IPTG(終濃度0.2 mmol/L)，此時調(diào)節(jié)培養(yǎng)溫度至28 ℃。

1.5 分析方法

菌體濃度測定:取適量發(fā)酵液，經(jīng)稀釋后，使用紫外可見分光光度計在波長600 nm 下測定光密度。

菌體干重測定:量取25 mL 發(fā)酵液，12 000 r/min離心10 min，菌體用生理鹽水清洗后再次離心，離心后菌體置于90 ～100 ℃烘箱中烘干至恒重，使用分析天平稱重計算菌體干重，菌體干重與吸光值之間的關(guān)系為:干重(gDCW/L)=0.327 ×吸光值(Abs)。

殘?zhí)菧y定:采用SBA40E 型生物傳感器分析儀進行測定。

轉(zhuǎn)化實驗:取1 mL 發(fā)酵液，12 000 r/min 離心10 min，去上清液，加入1 mL 150 mmol/L 2-氨基-4-甲硫基丁腈(緩沖體系Tris-HCl，pH 8.0)溶液。使用渦旋振蕩器使菌體重懸，將其置于恒溫混勻器中進行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，溫度40 ℃，轉(zhuǎn)速600 r/min。反應(yīng)10 min 后加入10 μL 質(zhì)量濃度36%的濃HCl 終止反應(yīng)，離心取上清液進行HPLC 檢測分析［6－8］。

HPLC 檢測方法:日本島津液相色譜儀;大連伊力特色譜柱:不銹鋼填充柱，填料為C18(250 mm ×4.6 mm);流動相:V(甲醇)∶V(水)=25∶75;流速1 mL/min，柱溫40 ℃，進樣量20 μL，紫外檢測波長210 nm。

酶活定義:每分鐘催化生成1 μmol 蛋氨酸所需要的菌體量記為1 個活力單位U;每克干菌體所含有的酶活數(shù)定義為U/gDCW;每升發(fā)酵液所含有的酶活數(shù)定義為U/L。

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵過程pH 控制對菌體生長和產(chǎn)酶的影響

發(fā)酵液的pH 值是發(fā)酵過程中的重要參數(shù)，pH值的變化影響菌體的生長和目標(biāo)產(chǎn)物的合成。一般而言，重組大腸桿菌生長的最適pH 為7.0 ～7.2，實驗中研究了未控制pH 和控制pH 恒定對菌體生長和產(chǎn)酶的影響。

從圖2 可以看出，當(dāng)未控制pH 進行分批發(fā)酵時，最大菌體量為2.57 gDCW/L，比酶活為2 141 U/gDCW;當(dāng)pH 恒定在7.0 左右進行分批發(fā)酵時，重組菌對數(shù)生長期有所延長，最大菌體量為3.09 gDCW/L，比酶活為2 241 U/gDCW，分別比未控制pH 進行分批發(fā)酵提高了20.23%和4.67%。由此可見，發(fā)酵時維持pH 恒定在7.0 左右，對菌體的生長和酶活都有很好的促進作用，所以在后續(xù)實驗中我們均控制pH 恒定在7.0。

2.2 初始葡萄糖濃度及葡萄糖補加策略對菌體生長和產(chǎn)酶的影響

碳源及其濃度是影響大腸桿菌發(fā)酵的關(guān)鍵因素。本實驗中選用葡萄糖作為初始碳源，但葡萄糖的添加量過大，菌體生長過于迅速，會產(chǎn)生“葡萄糖效應(yīng)”，產(chǎn)生乙酸等代謝副產(chǎn)物，既抑制了菌體生長又不利于蛋白的表達［13］，因此使用葡萄糖作為碳源時需要嚴(yán)格控制葡萄糖的濃度。選取葡萄糖的初始濃度為2 g/L、5 g/L、10 g/L 和15 g/L，發(fā)酵培養(yǎng)14 h，檢測發(fā)酵過程中葡萄糖的消耗(圖3)及其對菌體生長和酶活的影響(圖4)。

結(jié)合圖3 和4 可以看出，當(dāng)初始葡萄糖濃度為2 g/L 時，發(fā)酵6 h 后，葡萄糖已經(jīng)耗盡，不能滿足生長和產(chǎn)酶的需要;濃度過高(15 g/L)，葡萄糖消耗過快，產(chǎn)生了“葡萄糖效應(yīng)”，對菌體的生長和酶活都有抑制作用。綜合考慮葡萄糖的消耗、菌體的生長以及酶活的高低情況，選擇葡萄糖初始濃度5 g/L 較適宜，此時菌體濃度為5.32 gDCW/L，比酶活達2 200 U/gDCW。

當(dāng)初始葡萄糖濃度為5 g/L 時，分別選取糖濃度下降為2 g/L(圖5(a))和3 g/L(圖5(b))時進行反饋補料，每次補加50 mL 碳源補料培養(yǎng)基，比較兩種不同補料策略對菌體生長和產(chǎn)酶的影響。

圖2 pH 控制對菌體生長和酶活的影響(a)未控制pH;(b)控制pH 恒定Fig.2 Effects of pH on strain growth and enzyme activity(a)natural pH;(b)constant pH

圖3 不同初始葡萄糖濃度下葡萄糖的消耗情況Fig.3 The glucose consumption under the different initial concentration of glucose

由圖5 可知，發(fā)酵14 h 后，葡萄糖濃度基本維持在2 ～3 g/L，不再消耗，此時停止補料。結(jié)果表明，葡萄糖濃度降為2 g/L 時進行反饋補料，最大菌體量為7.83 gDCW/L，比酶活達2 215 U/gDCW(圖5(a));而葡萄糖濃度降為3 g/L 時進行反饋補料，最大菌體量為7.07 gDCW/L，比酶活達2 199 U/gDCW(圖5(b))，且補料過于頻繁，會增加發(fā)酵過程染菌率，影響葡萄糖利用率，碳氮比例增大，菌體生長緩慢，代謝不平衡，因此選擇葡萄糖下降為2 g/L 時開始補料。

圖4 初始葡萄糖濃度對菌體生長和酶活的影響Fig.4 Effects of initial concentration of glucose on strain growth and enzyme activity

圖5 葡萄糖補加策略對菌體生長和酶活的影響(a)2 g/L;(b)3 g/LFig.5 Effects of the fed strategy of glucose on strain growth and enzyme activity(a)2 g/L;(b)3 g/L

2.3 氮源補加策略對菌體生長和產(chǎn)酶的影響

分批補料過程中碳氮比例很重要。若碳氮比過低，菌體大量利用氮源，導(dǎo)致pH 偏高;若碳氮比過高，菌體會在酶的合成期因為缺乏前體物質(zhì)而產(chǎn)酶減少。Donowan 等［14］發(fā)現(xiàn)，氮源補料培養(yǎng)基中同時含有酵母粉和蛋白胨時，重組蛋白穩(wěn)定且細胞還能利用代謝合成的乙酸。實驗中分別選取3 種不同的氮源補加策略，考察其對菌體生長和產(chǎn)酶的影響:(a)初始氮源為蛋白胨12 g/L+酵母粉8 g/L，補加氮源補料培養(yǎng)基I;(b)初始氮源為蛋白胨8 g/L +酵母粉5.4 g/L，補加氮源補料培養(yǎng)基I;(c)初始氮源為蛋白胨4 g/L+酵母粉2.7 g/L，補加氮源補料培養(yǎng)基II，氮源初次補加時間與碳源初次補加時間相同，之后每隔2 h 補加50 mL 氮源補料培養(yǎng)基，共補加4 次，結(jié)果如圖6 所示。

圖6 氮源補加策略對菌體生長和酶活的影響(a)初始氮源為蛋白胨12 g/L+酵母粉8 g/L，補加氮源補料培養(yǎng)基I;(b)初始氮源為蛋白胨8 g/L +酵母粉5.4 g/L，補加氮源補料培養(yǎng)基I;(c)初始氮源為蛋白胨4 g/L +酵母粉2.7 g/L，補加氮源補料培養(yǎng)基IIFig.6 Effects of the fed strategy of nitrogen source on strain growth and enzyme activity

圖6 (a)是在初始發(fā)酵培養(yǎng)基中繼續(xù)補加氮源補料培養(yǎng)基I，菌體濃度有了很大的提高，但比酶活卻有小幅度的下降。圖6(b)與(a)相比，降低了初始發(fā)酵培養(yǎng)基中氮源濃度，從而導(dǎo)致碳源的消耗速度增加，菌體的生長速度較原來變慢;補加氮源之后，菌體生長速度明顯加快，后期繼續(xù)補加氮源，整個菌體生長過程和產(chǎn)酶過程延長。圖6(c)中由于初始發(fā)酵培養(yǎng)基中氮源濃度過低，前期菌體生長速率受到較大抑制，雖后期補加氮源，但整體菌體濃度和最大酶活都較(b)低。綜合以上因素，選擇(b)作為氮源補加策略。該策略下菌體濃度和酶活都大幅提高，最大菌體量13.68 gDCW/L，比酶活為2 148 U/gDCW，相較于單一補加葡萄糖，菌體量提高了74%。

2.4 誘導(dǎo)時機和誘導(dǎo)劑濃度對菌體生長和產(chǎn)酶的影響

通過碳氮源的分批補料發(fā)酵，菌體濃度有了大幅度的提高，但是比酶活有所下降。而誘導(dǎo)時機和誘導(dǎo)劑濃度是影響基因工程菌酶活的重要因素，誘導(dǎo)劑使攜帶質(zhì)粒的細胞生長速率顯著降低;誘導(dǎo)較早會使菌體和目的蛋白產(chǎn)量降低，而誘導(dǎo)較晚雖然菌體量有所提高，但細胞表達外源蛋白的時間減少。選取發(fā)酵時間為2、4、6、8 h 時添加誘導(dǎo)劑，考察其對菌體生長和產(chǎn)酶的影響，結(jié)果如圖7 所示。

圖7 誘導(dǎo)時機對菌體生長和比酶活的影響Fig.7 Effects of induction time on strain growth and enzyme activity

圖7 可以看出，在2 ～6 h 范圍內(nèi)，隨著起始誘導(dǎo)時間的延后，菌體量和比酶活逐漸增加，發(fā)酵6 h 時添加誘導(dǎo)劑，菌體量13.56 gDCW/L、比酶活2 450 U/gDCW，比發(fā)酵2 h 時添加誘導(dǎo)劑菌體量、比酶活分別增加了9.97%、15.57%;而8 h 時添加誘導(dǎo)劑雖然菌體量比2 h 時添加誘導(dǎo)劑的菌體量增加了14.35%，比酶活卻下降了76.67%。綜上所述，選擇發(fā)酵6 h左右添加誘導(dǎo)劑。

選取誘導(dǎo)劑濃度為0.1、0.2、0.4、0.6 mmol/L，考察誘導(dǎo)劑濃度對菌體生長和酶活的影響，實驗結(jié)果如圖8 所示。

從圖8 可以看出，IPTG 濃度在0.1 ～0.6 mmol/L范圍內(nèi)對菌體生長和酶活影響不大;其中IPTG 濃度為0.4 mmol/L 時菌體量與0.2 mmol/L 時相同，但其比酶活提高了8.75%，最大酶活為2 610 U/gDCW，因此選擇誘導(dǎo)劑IPTG 濃度為0.4 mmol/L。

圖8 誘導(dǎo)劑濃度對菌體生長和酶活的影響Fig.8 Effects of induction concentration on strain growth and enzyme activity

2.5 分批補料發(fā)酵穩(wěn)定性實驗

根據(jù)以上結(jié)果，建立以下發(fā)酵工藝:整個發(fā)酵過程始終控制發(fā)酵液pH 恒定在7.0 左右;初始碳源為葡萄糖5 g/L;初始氮源為蛋白胨8 g/L、酵母粉5.4 g/L;發(fā)酵過程中檢測葡萄糖的變化，當(dāng)葡萄糖濃度下降為2 g/L 左右開始每次補加50 mL 碳源補料培養(yǎng)基，發(fā)酵過程中維持葡萄糖濃度在2 ～3 g/L 之間;在補加葡萄糖的同時補加氮源補料培養(yǎng)基I，每隔2 h補加50 mL，共補加4 次;發(fā)酵6 h 后添加誘導(dǎo)劑IPTG，終濃度為0.4 mmol/L。結(jié)果如圖9 所示。

圖9 分批補料發(fā)酵穩(wěn)定性實驗Fig.9 The stability test of fed-batch fermentation

進行3 次驗證試驗，驗證實驗的分批補料發(fā)酵過程曲線均和圖9 保持一致，平均菌體量為13.7 gDCW/L，比酶活2 700 U/gDCW，體積酶活為36 990 U/L，表明前期優(yōu)化結(jié)果具有較好的穩(wěn)定性和可重復(fù)性。

3 結(jié)論

本文在5 L 發(fā)酵罐內(nèi)建立了工程菌E. coli BL21(DE3)/pET-28b-NIT 表達腈水解酶的分批補料培養(yǎng)工藝，考察了碳、氮源補加及誘導(dǎo)劑添加等因素對重組大腸桿菌生長和腈水解酶酶活的影響，通過優(yōu)化獲得菌體量可達13.7 gDCW/L，較優(yōu)化前提高了4.3倍;比酶活為2 700 U/gDCW，體積酶活高達36 990 U/L，比未優(yōu)化前提高了5.1 倍，實現(xiàn)了工程菌E. coli BL21 (DE3)/pET-28b-NIT 的高密度培養(yǎng)及腈水解酶的高效表達，對于后續(xù)蛋氨酸的生物催化法制備具有重要的意義。

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