楊潔芳，劉會(huì)平，俞佳，王淑，王浩

(天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津，300457)

肽(pepetides)是α －氨基酸以肽鍵形式連接而成的化合物，它是蛋白質(zhì)水解的中間產(chǎn)物［1］，具有優(yōu)于大豆蛋白的食品功能性和生物活性。工業(yè)生產(chǎn)中主要的制備方法是復(fù)合酶解法，利用內(nèi)切酶將大豆蛋白水解成分子量較小的肽，再由外切酶將疏水性氨基酸從多肽鏈的末端切下來。但酶解法產(chǎn)肽率相對(duì)較低，成本較高，而且得到的終產(chǎn)品往往帶有明顯的苦味［2］，限制了酶解法在多肽生產(chǎn)中的應(yīng)用。目前常用的脫苦方法有活性炭吸附［3］，超濾［4］，β-環(huán)糊精包埋［5］，蛋白酶優(yōu)選［6］，但這些方法都有一定的弊端，比如增加生產(chǎn)成本以及必需氨基酸的損失。

發(fā)酵法是一種集制備與脫苦于一體的高效方法［7］，肽段在微生物代謝活動(dòng)中產(chǎn)生的混合酶作用下釋放，同時(shí)微生物也借助多肽提高生長(zhǎng)代謝及產(chǎn)酶能力，循環(huán)協(xié)作，效率更高［8］，而且產(chǎn)品的風(fēng)味、色澤等感官特性均優(yōu)于酶法水解的產(chǎn)物［9］，增強(qiáng)了其在食品中的應(yīng)用。同時(shí)，固態(tài)發(fā)酵法具有節(jié)水節(jié)能，低能耗的優(yōu)點(diǎn)，有利于現(xiàn)代規(guī)模化生產(chǎn)。本實(shí)驗(yàn)通過實(shí)驗(yàn)確定了高產(chǎn)大豆肽的工藝，并對(duì)肽粗品進(jìn)行抗氧化能力的測(cè)定，旨在為大豆肽的工業(yè)生產(chǎn)和應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要原材料

大豆分離蛋白(蛋白質(zhì)86.51%)，大豆肽粉(淺黃色粉末，吸濕性強(qiáng)，短肽含量156.05 mg/g)購(gòu)自北京山松生物制品有限公司。

枯草芽孢桿菌(Bacillus subtitles)1398:由天津科技大學(xué)食品學(xué)院菌種保藏室提供。

1.2 化學(xué)試劑與培養(yǎng)基

1，1-二苯基-2-苦基苯肼(1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)，Gly-Gly-Tyr-Arg 標(biāo)準(zhǔn)品:美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品。

菌種計(jì)數(shù)及傳代培養(yǎng)基:牛肉膏0.5%，蛋白胨1.0%，NaCl 0.5%，pH 7.2，固體時(shí)加瓊脂2.0%。121 ℃滅菌15 ～20 min。

種子培養(yǎng)基:牛肉膏0.5%，蛋白胨1.0%，NaCl 0.5%，pH 7.2，121 ℃滅菌15 ～20 min。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 肽含量的測(cè)定

取0.1 g 干燥并研磨好的發(fā)酵產(chǎn)物，加入2.5 mL蒸餾水，于60 ℃水浴條件下浸提30 min。取等體積的10% TCA 加入到浸提液中，4 000 r/min 離心15 min，去除酸不溶性蛋白和長(zhǎng)鏈肽沉淀。取3.0 mL 上清液于1 號(hào)試管中，0 號(hào)試管加3 mL 蒸餾水做參比，然后向2 支試管中分別加入2.0 mL 雙縮脲試劑，充分混勻，靜置10 min，1 000 r/min 離心10 min，在可見光分光光度計(jì)上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)為540 nm，測(cè)定吸光度。重復(fù)操作3 次。

式中:c—多肽的濃度;n—稀釋倍數(shù);v—多肽液的體積;w—多肽的質(zhì)量。

1.3.2 平均肽鏈長(zhǎng)度的測(cè)定［10］

采用甲醛滴定法，在水解度較高時(shí)，水解度與平均肽鏈長(zhǎng)度關(guān)系大約表示為:

1.3.3 粗多肽抗氧化能力的測(cè)定

將干燥的發(fā)酵產(chǎn)物溶于10 倍水溶液中，于55 ℃水浴鍋中恒溫浸提60 min，將上層溶液先用定性濾紙抽濾，得到較為澄清的肽混合液，再用0.22 μm 微孔濾膜進(jìn)行微濾，得到粗多肽溶液。將此溶液進(jìn)行真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到粗肽濃縮液，再分裝至平皿中進(jìn)行凍干，并進(jìn)行抗氧化能力的測(cè)定(DPPH·［11］、O2－·［12］、·OH［13］清除能力)。

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵法制備大豆蛋白活性肽工藝優(yōu)化

2.1.1 蔗糖添加量對(duì)大豆肽的影響

以大豆分離蛋白為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別添加0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%的蔗糖進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。

由圖1 可知，平均鏈長(zhǎng)隨著蔗糖添加量的增加先增加后減少，而肽含量先略微增加后顯著下降，過量的碳源不但不能完全被微生物所利用，而且會(huì)影響菌種產(chǎn)酶水解蛋白的能力，使短肽水解成單個(gè)氨基酸的趨勢(shì)增強(qiáng)，而蛋白水解成短肽的趨勢(shì)減弱，當(dāng)蔗糖添加量達(dá)到2.0%后，短肽水解成單個(gè)氨基酸的程度大于蛋白水解成肽的程度，使得短肽含量和平均鏈長(zhǎng)均顯著下降。綜合兩個(gè)指標(biāo)的考慮，選擇蔗糖添加量為1.0%為最優(yōu)。

圖1 蔗糖添加量對(duì)大豆肽的影響Fig.1 Effect of sucrose content on soybean peptides

2.1.2 水分添加量對(duì)大豆肽的影響

選擇40%、60%、80%、100%、120%的水分添加量［14］，接種量2.0%，36 ℃發(fā)酵培養(yǎng)48 h，進(jìn)行加水量的單因素實(shí)驗(yàn)。

由圖2 可知，隨著水分添加量的增加，大豆蛋白逐漸被水解成更短的肽鏈，而肽含量先增加后有降低的趨勢(shì)，2 個(gè)指標(biāo)均在加入多于60%的水后變化不大，說明水分添加量不足會(huì)嚴(yán)重影響菌種生長(zhǎng)及代謝能力，而水分添加量達(dá)到60%以后，短肽水解成單個(gè)氨基酸的程度略大于蛋白水解成短肽的程度。水分添加量60%條件下，氧氣含量比較適合菌種的生長(zhǎng)和酵解作用且能耗小不易污染，所以選擇水分添加量60%為最佳值進(jìn)行下面的單因素實(shí)驗(yàn)。

圖2 水分添加量對(duì)大豆肽的影響Fig.2 Effect of water content on soybean peptides

2.1.3 接種量對(duì)大豆肽的影響

加入確定量的蔗糖和水，選擇1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%的接種量，在36 ℃條件下發(fā)酵48 h，進(jìn)行接種量的單因素實(shí)驗(yàn)。

由圖3 可知，隨著接種量的增加，蛋白逐步被酵解成短肽，在接種3.0%時(shí)達(dá)到最短，肽含量變化則呈先上升后下降的趨勢(shì)，同樣在接種3.0%時(shí)達(dá)到最大。說明接種量小，過量的碳氮源不能被充分利用，造成浪費(fèi)。但接種量過大，水分及養(yǎng)分不能滿足細(xì)菌的生長(zhǎng)代謝，菌種之間也會(huì)相互抑制，造成酶解產(chǎn)肽量顯著下降。所以選擇接種量3.0%為最佳的接種量。

圖3 接種量對(duì)大豆肽的影響Fig.3 Effect of inoculation dose on soybean peptides

2.1.4 發(fā)酵溫度對(duì)大豆肽的影響

加入確定量的蔗糖和水，接種3.0%的枯草芽孢桿菌，分別在24、28、32、36、40 ℃條件下發(fā)酵48 h，進(jìn)行發(fā)酵溫度的單因素實(shí)驗(yàn)。

由圖4 可知，枯草芽孢桿菌在28 ～36 ℃生長(zhǎng)良好，溫度低于28 ℃，菌種生長(zhǎng)代謝緩慢，產(chǎn)肽量較小，高于28 ℃后，含肽量逐漸減小。而平均鏈長(zhǎng)隨著溫度的升高先減小后增加，在32 ℃時(shí)達(dá)到最小值。說明32 ℃條件下菌種生長(zhǎng)代謝處于最佳狀態(tài)，能夠最大程度的產(chǎn)生較短的小肽，超過這一溫度，菌種生長(zhǎng)代謝作用受抑制，內(nèi)切作用大于外切作用。綜合2 個(gè)指標(biāo)考慮，選擇32 ℃為最優(yōu)條件。

圖4 發(fā)酵溫度對(duì)大豆肽的影響Fig.4 Effect of incubation temperature on soybean peptides

2.1.5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)大豆肽的影響

加入確定量的蔗糖和水，接種確定量的枯草芽孢桿菌，在一定溫度下發(fā)酵24、36、48、60、72 h，進(jìn)行發(fā)酵時(shí)間的單因素實(shí)驗(yàn)。

由圖5 看出，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，菌種逐漸將蛋白分解成短肽甚至單個(gè)氨基酸，肽含量在36 h 時(shí)達(dá)到最大。而平均鏈長(zhǎng)不斷減小，到48 h 后基本不變，說明時(shí)間過長(zhǎng)，菌種進(jìn)入衰亡期，產(chǎn)酶能力下降。綜合兩個(gè)指標(biāo)，選擇發(fā)酵36 h 為最佳。以此為依據(jù)設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)。

圖5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)大豆肽的影響Fig.5 Effect of incubation time on soybean peptides

2.1.6 優(yōu)化發(fā)酵工藝的正交實(shí)驗(yàn)

經(jīng)過分析上面單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)了5 因素4水平正交實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 L16(45)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 1 L16(45)orthogonal experimental design and results

根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果，各個(gè)因素對(duì)肽含量的影響順序依次為:接種量＞蔗糖添加量＞水分添加量＞發(fā)酵溫度＞發(fā)酵時(shí)間。最優(yōu)條件為:蔗糖添加量0.5%，水分添加量70%，接種量2.0%，32 ℃條件下發(fā)酵32 h。進(jìn)行驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，測(cè)得短肽含量為252.95 mg/g。

各個(gè)因素對(duì)平均肽鏈長(zhǎng)度的影響順序依次為:水分添加量＞發(fā)酵溫度＞蔗糖添加量＞接種量＞發(fā)酵時(shí)間，最優(yōu)條件為:蔗糖添加量2.0%，水分添加量80%，接種量3.0%，32 ℃條件下發(fā)酵48 h。水分添加量對(duì)平均肽鏈長(zhǎng)度的影響最顯著，水分既是微生物生長(zhǎng)代謝必需的物質(zhì)，又是酶水解蛋白質(zhì)的必要條件，水分添加量過低，對(duì)菌種的生長(zhǎng)代謝和酶的水解作用都不利，但過高的水分又會(huì)使氧氣含量下降，不利于菌的生長(zhǎng)。進(jìn)行驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，測(cè)得平均肽鏈長(zhǎng)度為4.0。

表2 方差分析表Table 2 Table of variance analysis (n=5)

綜合2 個(gè)指標(biāo)考慮，以肽含量為終指標(biāo)時(shí)用料更省，發(fā)酵周期更短，更利于工業(yè)生產(chǎn)需要。

2.2 各樣品的抗氧化能力

向體內(nèi)補(bǔ)充抗氧化劑，清除過多的自由基或中止體內(nèi)自由基反應(yīng)，可防止線粒體腫脹和抑制膜的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、蛋白質(zhì)交連、多糖的降解等的發(fā)生，對(duì)保護(hù)生物膜結(jié)構(gòu)與功能的完整性，抑制自由基誘發(fā)的疾病和增強(qiáng)體質(zhì)以及治療疾病都有重要意義。各樣品的DPPH·、O2－·和·OH 清除率見表3。

表3 樣品DPPH·、O2－·和·OH 清除能力Table 3 DPPH·，O2－· and ·OH clearance capacity of each sample

由表3 看出，市售肽與發(fā)酵肽均有一定的DPPH·、O2－·和·OH 清除能力，且發(fā)酵肽3 種自由基清除率較市售品分別提高了119.53%，26.02% 和65.56%。說明發(fā)酵法制備大豆肽這一工藝更好的激發(fā)和保留了其中的抗氧化活性成分，有效提高了肽的自由基清除能力。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以大豆肽含量以及平均肽鏈長(zhǎng)度為指標(biāo)，通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)，對(duì)發(fā)酵法制備大豆肽的工藝進(jìn)行了優(yōu)化。確定最優(yōu)工藝條件:蔗糖添加量0.5%，水分添加量70%，接種量2.0%，32 ℃條件下發(fā)酵32 h，此條件下測(cè)得短肽含量為252.95 mg/g;蔗糖添加量2.0%，水分添加量80%，接種量3.0%，32 ℃條件下發(fā)酵48 h，此條件下測(cè)得平均肽鏈長(zhǎng)度為4.0。發(fā)酵肽的DPPH·，O2－·和·OH 清除率分別為45.18%，55.50%和57.63%，較市售肽分別提高了119.53%，26.02%和65.56%。結(jié)果表明，發(fā)酵法制備大豆肽這一工藝有效的提高了肽的產(chǎn)率以及樣品的抗氧化能力。

［1］ 趙芳芳．大豆肽的生物學(xué)功能研究［D］．北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004．

［2］ 龐宗文，李敏，李樹波，等． 產(chǎn)蛋白酶毛霉的分離篩選及發(fā)酵豆粕產(chǎn)大豆肽的初步研究［J］． 現(xiàn)代食品科技，2010，26(9):956 －961．

［3］ 萬琦，陸兆新，高宏． 脫苦大豆多肽產(chǎn)生菌的篩選及其水解條件的優(yōu)化［J］． 食品科學(xué)，2003，24(2):29 －31．

［4］ Helbig N B，Ho L，Christy G E，et a1． Debittering of skim milk hydrolysates by adsorption for incorporation into acidic bevervages［J］． J Food Sci，1980，45(2):331 －335．

［5］ Hou L，Wang J，Zhang D． Optimization of debittering of soybean antioxidant hydrolysates with β-cyclodextrins using response surface methodology ［J］． J Food Sci Technol，2013，50(3):521 －527．

［6］ Nishiwaki T，Yoshimizu S，F(xiàn)uruta M，et a1． Debittering of enzymatic hydrolysates using an aminopeptidase from the edible basidiomycete Grifola frondosa ［J］． J Biosci Bioeng，2002，93(1):60 －63．

［7］ Ichimura T，Hu J，Aita D Q，Maruyama S． Angiotensin Iconverting enzyme inhibitory activity and insulin secretion stimulative activity of fermented fish sauce［J］． J Biosci Bioeng，2003，96(5):496 －499．

［8］ Frias J，Song Y S，Martinez －Villaluenga C，et a1． Immunoreactivity and amino acid content of fermented soybean products［J］． J Agric Food Chem，2008，56(1):99 －105．

［9］ Tan T W，Zhang M，Wang B W，et a1． Screening of high lipase producing Candid and production of lipase by Fermentation［J］． Process Biochemistry，2003，39(4):459－465．

［10］ 李建杰，榮瑞芬． 復(fù)合酶解制備核桃多肽工藝條件的優(yōu)化［J］． 中國(guó)油脂，2011，36(1):22 －26．

［11］ Naciye Erkan，Guler Ayranci，Erol Ayranci． Antioxidant activities of rosemary (Rosmarinus Officinalis L)extract，blackseed (Nigella sativa L．)essential oil，carnosic acid，rosmarinic acid and sesamol［J］． Food Chemistry，2008，110(1):76 －82．

［12］ Chobert J M，Bertrand－Hard C，Nicolas M G． Solubility and emulsifying properties of caseins and whey proteins modified enzimatically by trypsin ［J］． J Agri Food Chem，1988，36(5):883 －892．

［13］ 王振宇． 紅松松仁抗氧化肽的制備及抗氧化活性評(píng)價(jià)［J］． 食品與發(fā)酵工業(yè)，2010，36(7):78 －82．

［14］ 張吉鹍． 多菌種組合固態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)大豆肽蛋白飼料［J］． 江西飼料，2011(1):1 －4．