韋國兵，胡奇軍，廖夫生

HPLC法測定小柴胡顆粒中黃芩苷的含量研究

*韋國兵，胡奇軍，廖夫生

（江西中醫(yī)藥大學藥學院，江西，南昌 330004）

建立小柴胡顆粒中黃芩苷的含量測定方法。采用高效液相色譜法。色譜柱為Kromasil 100-5 ODS2（5 μm，250 mm × 4.6 mm），柱溫25 ℃，流動相甲醇—水—0.1 mol/L磷酸（45:55:0.2），流速為1 mL/min，檢測波長280 nm。在上述條件下，黃芩苷在0.00272 μg/mL ~0.0544 μg/mL(r = 0.9997)范圍具有良好的線性關(guān)系，平均回收率為99.72，RSD = 0.44%。本方法測定小柴胡顆粒中的黃芩苷含量操作簡單、準確且快速，可作為小柴胡顆粒中黃芩苷的含量測定方法。

HPLC；小柴胡顆粒；黃芩苷；含量

小柴胡顆粒由柴胡、人參、黃芩、大棗、半夏、生姜、甘草七味藥組成，具有解表散熱，舒肝和胃之功效。用于寒熱往來，胸脅苦滿，心煩喜吐，口苦咽干之癥狀，常用于治療肝硬化、淋巴腺炎、膽結(jié)石、急性胰腺炎、胸膜炎、產(chǎn)褥熱、急慢性膽囊炎、膽汁返流性胃炎、胃潰瘍等少陽證者[1-2]。黃芩是小柴胡顆粒的主藥，黃芩苷的含量高低直接影響著小柴胡顆粒的療效，有必要對小柴胡顆粒中黃芩苷的含量進行測定。為更好地控制小柴胡顆粒的藥品質(zhì)量，以黃芩苷含量為指標，我院建立了HPLC法測定該制劑中黃芩苷的含量測定方法。

1 儀器與試劑

Agilent1200型高效液相色譜儀；Kromasil100-5c18ODS2（5 μm，250 mm × 4.6 mm）型色譜柱、AB104-N(METTER)電子天平；KQ-100型超聲波清洗機（昆山超聲儀器有限公司）。

小柴胡顆粒（江西汪氏藥業(yè)有限公司，批號：20120603，規(guī)格：10 g/包）；黃芩苷購自中國藥品生物檢定所（純度＞99%）；試劑：甲醇為色譜純；其余均為分析純；水為雙蒸餾水。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱Kromasil 100-5 C18(250 mm × 4.6 mm)；流動相：甲醇-水-磷酸(45:55:0.2)；檢測波長：280 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：25 ℃；進樣量為10 μL。理論塔板數(shù)以黃芩苷計算不低于2000。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取干燥的黃芩苷對照品適量于容量瓶中，加甲醇溶解配置成每25 mL含3.4 mg的溶液，超聲30 min，加甲醇至刻度得到濃度為0.136 mg/mL的對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取小柴胡顆粒適量，用研缽研細，精密稱定小柴胡粉末1.6003 g于50 mL容量瓶中，加入50%的甲醇30 mL，超聲處理30 min，放冷，繼續(xù)用50%的甲醇定容至刻度，后精密量取本溶液5 mL于10 mL容量瓶中，加50%甲醇溶液稀釋到刻度，即得供試品溶液[3]。

2.4 測定方法

分別進樣對照品溶液和供試品溶液各10 μL 在上述條件下進樣，記錄色譜圖。色譜圖如下：

圖1 黃芩苷對照品圖譜

圖2小柴胡顆粒供試品圖譜

2.5 線性關(guān)系的建立

精密吸取0.136mg/mL的黃芩苷對照品溶液0.2、0.4、1.0、2.0、3.0和4.0mL分別置于10mL容量瓶中，分別加50%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，分別得到0.00272、0.00544、0.0136、0.0272、0.0408、0.0544mg/mL的對照品溶液。分別取以上六種對照品溶液各10μL按2.4項下方法進樣，測定峰面積，以進樣量X(μg)為橫坐標，峰面積Y為縱坐標作線性回歸，黃芩苷的線性回歸方程為：Y=4746.5x-79.640，r=0.9997，結(jié)果表明黃芩苷對照品在0.00272μg/mL ~0.0544μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.6 重復進樣精密度實驗

取濃度為0.00272 mg/mL的對照品溶液，按2.4項下的方法重復連續(xù)進樣5次，每次進樣10 μL，記錄色譜圖，測定峰面積，平均峰面積6125，計算RSD = 1.38%（= 5），表明本方法和儀器具有良好的精密度。

2.7 供試品重復性實驗

取同一批號（20120603）樣品5份，按2.3項下的測定方法操作，制備供試品溶液5份，依次進樣，各進樣10 μL，測定黃芩苷峰面積，測得黃芩苷含量為1.973 mg/g，計算RSD = 0.39%（= 5），表明本方法具有良好的重復性。

2.8 供試品溶液穩(wěn)定性試驗

取配置好的重復性下的供試品溶液（批號：20120603）一份分別放置0、2、4、6、8和12小時后按上述方法進樣，各進樣10μL，測定峰面積，計算得RSD=1.02%（=6），表明供試品溶液在室溫放置12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.9 加樣回收實驗

精密稱取已知含量的小柴胡顆粒樣品3份，按照供試品溶液的制備方法制成溶液，再分別用移液管精密移取1mL溶液于三只10mL容量瓶中，進行編號，再分別加入供試品中黃芩苷含量的80%，100%，120%的黃芩苷對照品，按供試品溶液的制備方法處理，制備3種供試品溶液共9份，各精密進樣10μL進行測定，測定色譜峰面積，測定小柴胡顆粒中黃芩苷的含量并計算平均加樣回收率，表明該方法具有較好的回收率。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收實驗結(jié)果

2.9 樣品的含量測定

取3批小柴胡顆粒藥品（批號：20120603、20120604、20120605），按供試品溶液制備方法制備供試品溶液，進行含量測定。精密吸取供試品溶液10 μL，注入液相色譜儀，按照外標法根據(jù)峰面積計算樣品中黃芩苷的含量，結(jié)果見表2。

表2 小柴胡顆粒含量測定結(jié)果

3 討論

3.1 提取溶劑的選擇

黃芩苷為一種黃酮衍生物，具有顯著的生物活性，其水溶性很小，具有一定的脂溶性，我們分別用甲醇，50%甲醇和70%甲醇作為提取溶劑并超聲提取30 min進行提取后測定黃芩苷的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在超聲提取30 min時用50%的甲醇溶液作提取溶劑時得到的色譜峰峰型最好[4]，而且分離完全，因此，采用50 %的甲醇作為提取溶劑進行樣品中黃芩苷的提取溶劑。

3.2 流動相的選擇

本實驗對文獻提供的色譜條件分別進行了考察分析。韋國兵等在高效液相色譜法測黃芩苷[5-8]的含量基礎(chǔ)上，對流動相甲醇—水—磷酸的比例進行試驗，發(fā)現(xiàn)改變流動相比例會使峰型變化并影響分離效果，最終確定甲醇—水—磷酸（45:55:0.2）為最佳的流動相，在此流動相條件下能排除供試品溶液中其他成分的干擾，分離完全且峰型理想。

4 結(jié)論

當前關(guān)于小柴胡顆粒中黃芩苷的含量測定方法很多，但以高效液相色譜法最為可靠且操作簡單，準確度高。本實驗通過對提取溶劑與提取方法、流動相等色譜條件的選擇對小柴胡顆粒中的黃芩苷進行快速、準確地定量分析研究結(jié)果表明，本方法操作簡便、靈敏度高、重現(xiàn)性好，結(jié)果可靠；而且與姜春玲文獻三相比，本方法具有流動相的分離效果更好、線形范圍更寬、峰形理想且其他成分干更小且操作簡單、重復性浩的優(yōu)點，可用于小柴胡顆粒的質(zhì)量控制。而且與《中國藥典》（2010版）方法相比，采用甲醇—水—磷酸（45:55:0.2）為流動相時，更能排除供試品溶液中其他成分的干擾，分離更完全且峰型更理想，分離時間縮短的優(yōu)點，為小柴胡顆粒的質(zhì)量標準的提高提供了實驗依據(jù)。

[1] 吳素琴，姜桂寧.小柴胡湯臨床應(yīng)用近況[J]. 河南中醫(yī)學藥刊,1998,13(5):62.

[2] 李舒敏.小柴胡湯在內(nèi)科臨床上的應(yīng)用概況[J] . 廣西中醫(yī)學院學報,2000,21(8):495-496.

[3] 姜春玲,李大偉. 小柴胡顆粒中黃芩苷的含量測定[J]. 黑龍江科技信息,2011,5(15):26.

[4] 申去非,張莉,朱鐵梁,等.黃芩苷含量測定方法研究進展[J].中醫(yī)藥信息,2009,26(4):14-16.

[5] 韋國兵.HPLC法測定二妙膠囊中鹽酸小檗堿的含量[J]. 中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志,2010,20(11):1701-1703.

[6] 孟姝,楊友田,林玉蓮,等.利膽片中黃芩苷的含量測定及其質(zhì)量評價[J].中國藥房,2013,24(8):736-738.

[7] 羅王聰,唐雪梅,周健,等.黃芩苷的提取工藝及高效液相含量測定[J].現(xiàn)代中藥研究與實踐,2012,26(3):53-56.

[8] 劉君, 黎志福, 歐陽春華.三黃滴鼻液中黃芩苷含量測定[J].中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用,2011,5(12):12-13.

Determination of baicalin in Yinhuang Oral Liquid by HPLC

*WEI Guo-bing，HU Qi-jun，LIAO Fu-sheng

（Department of Pharmacy, Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanchang, Jiangxi 330004, China）

：To establish a HPLC method for determining the amount of baicalin in Xiaochaihu granules.: HPLC analysis was carried out on a Kromasil 100-5 ODS2 (5 μm, 250 mm × 4.6 mm) column with the temperature at 25 ℃. The mobile phase was methanol- water-0.1 mol/L phosphoric acid ( 45: 55: 0.2) with the flow rate of 1.0 mL·min-1, and the detection wavelength was set at 280 nm.: The linear range of baicalin was 0.00272~0.0544 μg/mL (=0.9997), the average recovery was 99.72%, and the RSD was 0.44%.: The method is simple, rapid, accurate, and can be used for the quality control of the Xiaochaihu granules and its content determination.

HPLC; Xiaochaihu granules; baicalin; content

R944.5

B

10.3969/j.issn.1674-8085.2013.06.016

1674-8085(2013)06-0078-03

2013-08-09；

2013-10-09

江西省教育廳科技計劃項目(GJJ10213)，江西中醫(yī)藥大學校級中醫(yī)藥專項(2012-1-10)

*韋國兵(1976-），男，湖南沅江人，副教授，主要從事藥物質(zhì)量標準與中藥活性成分研究(E-mail:weigb@163.com);

胡奇軍(1975-），男，湖南益陽人，講師，主要從事藥物質(zhì)量標準與中藥活性成分分析(E-mail:weigb@163.com);

廖夫生(1977-），男，江西峽江人，副教授，主要從事藥物質(zhì)量標準與中藥活性成分研究(E-mail:lfs960352@163.com).