鐘君偉，朱永安，孟慶磊，王錫榮，劉紅彩 (山東省淡水水產(chǎn)研究所，山東省淡水水產(chǎn)遺傳育種重點(diǎn)研究室，山東 濟(jì)南 250013)

氨氮對(duì)2種規(guī)格克氏原螯蝦的急性毒性研究

鐘君偉，朱永安，孟慶磊，王錫榮，劉紅彩 (山東省淡水水產(chǎn)研究所，山東省淡水水產(chǎn)遺傳育種重點(diǎn)研究室，山東 濟(jì)南 250013)

采用常規(guī)生物急性毒性試驗(yàn)法，探討了氨氮對(duì)2種規(guī)格克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)的急性毒性。結(jié)果表明,在水溫(24.93±2.7)℃條件下，離子氨氮對(duì)體重為(6.8±1.2)g和體重為(12.8±1.1)g的克氏原螯蝦的24、48、72、96h的半數(shù)致死濃度(LC50)分別為289.36、219.50、185.97、169.83mg/L和441.88、368.61、305.07、262.64mg/L，安全質(zhì)量濃度(SC)分別為37.89mg/L和76.95mg/L；非離子氨對(duì)體重為(6.83±1.25)g及體重為(12.78±1.14)g的克氏原螯蝦的24、48、72、96h的半數(shù)致死濃度(LC50)分別為9.70、7.89、7.22、6.70mg/L和12.65、11.18、10.91、9.11mg/L，安全質(zhì)量濃(SC)度分別為1.56mg/L和2.62mg/L?？耸显r對(duì)氨氮有較強(qiáng)的耐受力。

克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)；氨氮；非離子氨；半致死濃度；安全濃度

克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)俗稱淡水小龍蝦，英文名稱譯為“紅沼澤螯蝦” (RedSwampCrayfish)，分類學(xué)上屬節(jié)肢動(dòng)物門甲殼綱軟甲亞綱十足目螯蝦亞目蜊蛄科原螯蝦屬?？耸显r原產(chǎn)于北美洲,1929年由日本引種到我國(guó),它適應(yīng)性強(qiáng),食性廣,繁殖力強(qiáng),幼體成活率高,廣泛分布于淺水溝渠中。該蝦味道鮮美,營(yíng)養(yǎng)豐富,肉質(zhì)細(xì)嫩,易消化,具有補(bǔ)腎、健胃、防止膽固醇蓄積等作用,開發(fā)前景廣闊。近年來，克氏原螯蝦養(yǎng)殖業(yè)在消費(fèi)需求的帶動(dòng)下已得到較快的發(fā)展，其相關(guān)研究也日益增多。目前，有關(guān)克氏原螫蝦的研究主要集中在生物學(xué)特性、形態(tài)發(fā)育、繁殖及養(yǎng)殖技術(shù)、營(yíng)養(yǎng)生理與基礎(chǔ)代謝等方面[1-4]，而水體污染對(duì)其毒性效應(yīng)的研究較少。國(guó)內(nèi)已有的報(bào)道研究了水體中關(guān)鍵因子(如亞硝酸鹽、氨氮、硫化物)對(duì)克氏原螯蝦幼蝦的毒性效應(yīng)[5,6]，但仍缺乏水體中關(guān)鍵因子對(duì)克氏原螯蝦成蝦的毒性效應(yīng)研究。在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中，水體污染往往引起水產(chǎn)動(dòng)物的生理異常甚至死亡，其產(chǎn)生的毒性作用直接影響動(dòng)物的生存、生長(zhǎng)和發(fā)育。本研究探討了水體中氨氮對(duì)2種不同規(guī)格的克氏原螯蝦成蝦的急性毒性作用，旨在找出其安全濃度，為克氏原螯蝦的健康養(yǎng)殖提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用克氏原螫蝦成蝦取自山東省東平縣第一淡水養(yǎng)殖試驗(yàn)場(chǎng)，成蝦在室內(nèi)暫養(yǎng)7d。暫養(yǎng)和試驗(yàn)容器均為裝有20L水的塑料水族箱(57cm ×40cm ×34cm)，試驗(yàn)前24h停食，并從中選擇體質(zhì)健壯、體色一致、活動(dòng)力強(qiáng)和附肢完整的成蝦作為毒性試驗(yàn)用蝦。

1.2 試驗(yàn)方法

克氏原鰲蝦按體重分成2組，A組體長(zhǎng)(6.8±0.6)cm，體重(6.8±1.2)g；B組體長(zhǎng)(7.4±0.5)cm，體重(12.8±1.1)g。經(jīng)預(yù)備試驗(yàn)，確定各組藥物質(zhì)量濃度范圍(96h全活質(zhì)量濃度上限和24h全部致死質(zhì)量濃度下限)后，在室溫條件下，按等對(duì)數(shù)間距設(shè)置8個(gè)質(zhì)量濃度梯度組和1個(gè)清水對(duì)照組，試驗(yàn)采用半靜水停食實(shí)驗(yàn)法。試驗(yàn)開始前，根據(jù)設(shè)定質(zhì)量濃度準(zhǔn)確稱量NH4Cl放入裝有20L水的塑料水族箱(57cm ×40cm ×34cm)溶解完全后，A組每一質(zhì)量濃度梯度各放克氏原螯蝦15尾，B組每一質(zhì)量濃度梯度各放克氏原螯蝦10尾，組內(nèi)設(shè)3個(gè)重復(fù)。試驗(yàn)期間停食，試驗(yàn)開始的前8h連續(xù)觀察，及時(shí)取出死亡成蝦并排污，記錄24、48、72、96 h各組蝦的癥狀及死亡數(shù)。其死亡的個(gè)體以鑷子碰觸蝦體腹部完全無反應(yīng)為標(biāo)準(zhǔn)。

由于氨氮化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，尤其在充氧條件下其濃度可能會(huì)有較大變化。因此測(cè)定了充氧條件下氨氮 24h內(nèi)的變化情況。試驗(yàn)在1L玻璃燒杯中進(jìn)行，氨氮初始濃度設(shè)為100mg/L和 600mg/L，每組設(shè) 3個(gè)平行組，試驗(yàn)開始后 4、8、12、16、24h采樣，測(cè)定氨氮濃度。為保證試驗(yàn)期間藥物濃度的穩(wěn)定，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果確定每24h全部換液1次。

1.3 數(shù)據(jù)處理與計(jì)算

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，參照譚蘋[7]的方法，按改良寇氏法求出各藥物的半數(shù)致死質(zhì)量濃度(LC50)。

(1)當(dāng)最小劑量組的死亡率為0%，最大劑量組的死亡率為100%時(shí)，可按下列公式計(jì)算LC50：

LC50=lg-1[Xm-i(∑p-0.5)]

(1)

(2)當(dāng)最小劑量組的死亡率大于0%而又小于30%，或最大劑量組的死亡率小于100%而又大于70%時(shí)，可按下列校正公式計(jì)算LC50：

(2)

式(1)、式(2)中，Xm為最大劑量組劑量的對(duì)數(shù)，i為相鄰兩組對(duì)數(shù)劑量之差值(大劑量組減小劑量組)，Pm為最大劑量組死亡率，Pn為最小劑量組死亡率，P為各組死亡率，n為每組動(dòng)物數(shù)。各組試驗(yàn)動(dòng)物的安全質(zhì)量濃度(SC)按下式計(jì)算：

安全濃度(SC)=48hLC50×0.3/(24hLC50/ 48hLC50)2

式中，24 hLC50、48 hLC50分別為24h、48h的半致死質(zhì)量濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 充氧條件下氨氮濃度的變化

圖1 氨氮濃度隨時(shí)間的變化情況

在(5.24±0.63)mg/L溶氧水平下，24h氨氮濃度 (100mg/L和600mg/L)的損失率分別為 12.06%和12.56% (圖1)。從圖1可看出，氨氮濃度隨時(shí)間逐漸降低，但24h內(nèi)其降低程度小于20%。在本試驗(yàn)中，每24h換毒液 1次能夠保證毒物的有效濃度維持在 85% 以上。一般而言，急性試驗(yàn)中毒物的濃度變化小于20% 就可以用初始濃度來說明該毒物的急性毒性，盡管依據(jù)初始濃度計(jì)算的LC50值有所偏高，但是能夠準(zhǔn)確反映出克氏原鰲蝦對(duì)氨氮的耐受程度，滿足了急性毒性試驗(yàn)中毒物濃度變化小于 20%的試驗(yàn)要求。

2.2 中毒癥狀

觀察發(fā)現(xiàn)，2種規(guī)格的克氏原螯蝦在不同氨氮質(zhì)量濃度的下表現(xiàn)出了不同的中毒反應(yīng)。試驗(yàn)初期，A、B2組克氏原螯蝦活動(dòng)狀況與對(duì)照組基本相似，都散落在箱體底部緩慢爬動(dòng)。試驗(yàn)開始2h后，高濃度組出現(xiàn)中毒癥狀，有部分蝦腹部朝上，出現(xiàn)間歇性痙攣行為，若受觸動(dòng)，反應(yīng)遲鈍。高氨氮濃度條件下其余蝦游動(dòng)遲緩，游泳足擺動(dòng)緩慢。4h后，A組在氨氮濃度分別為595.58mg/L和436.46mg/L的2個(gè)濃度組各有1尾蝦死亡，而B組無死亡蝦出現(xiàn)。8h后，A、B2組克氏原螯蝦在高氨氮濃度條件下均有死亡蝦出現(xiàn)，死亡個(gè)體側(cè)臥于水底，身體僵直。24h內(nèi)，A組在氨氮質(zhì)量濃度低于100mg/L時(shí)，克氏原螯蝦活動(dòng)狀況幾無變化。B組在氨氮質(zhì)量濃度低于154mg/L時(shí)，克氏原螯蝦活動(dòng)狀況正常。其他各濃度組試驗(yàn)蝦隨著時(shí)間的推移，也先后不同程度地出現(xiàn)上述中毒癥狀。

2.3 氨氮對(duì)克氏原螯蝦的急性毒性效應(yīng)

從表1可看出，隨著氨氮質(zhì)量濃度的增加和試驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng)，氨氮對(duì)不同規(guī)格的克氏原螯蝦的急性毒性作用增強(qiáng)，克氏原螯蝦死亡率上升，但是不同氨氮質(zhì)量濃度對(duì)不同規(guī)格的克氏原螯蝦急性毒性影響卻不盡相同，具體表現(xiàn)為：①在24h內(nèi)，A組(小規(guī)格克氏原螯蝦)在氨氮質(zhì)量濃度為125.88mg/L時(shí)出現(xiàn)死亡，而B組(大規(guī)格克氏原螯蝦)在氨氮質(zhì)量濃度為194.66 mg/L時(shí)出現(xiàn)死亡，且A組的死亡遠(yuǎn)高于B組。②氨氮質(zhì)量濃度對(duì)不同規(guī)格的克氏原螯蝦的急性毒性強(qiáng)度不同，A組在96h內(nèi)全部死亡的最高氨氮質(zhì)量濃度為436.46mg/L，而B組為501.27mg/L。

表1 氨氮對(duì)克氏原螯蝦成蝦的急性毒性試驗(yàn)結(jié)果

注：非離子氨濃度以各水族箱實(shí)測(cè)pH、水溫24.9℃條件下參照于波等[8]的方法換算得到。

表2 氨氮對(duì)克氏原螯蝦的半致死濃度(LC50)及安全質(zhì)量濃度(SC)

在相同氨氮質(zhì)量濃度下，除去最低劑量組，染毒時(shí)間越長(zhǎng)，成蝦的死亡率越高；而在相同的染毒時(shí)間內(nèi)，濃度越高成蝦的死亡率越高。依據(jù)表1的數(shù)據(jù)，根據(jù)改良寇氏法計(jì)算氨氮對(duì)不同規(guī)格的克氏原螯蝦的半致死濃度(LC50)及安全質(zhì)量濃度(SC)。具體結(jié)果見表2。

由表2可以看出，離子氨氮對(duì)克氏原螯蝦試驗(yàn)蝦的安全質(zhì)量濃度(SC)A組為37.89mg/L，B組為76.95mg/L；非離子氨對(duì)克氏原螯蝦試驗(yàn)蝦的安全質(zhì)量濃度(SC)A組為1.56mg/L，B組為2.62mg/L。

3 討論

在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中，氨氮濃度突變是一個(gè)比較重要的脅迫因子，當(dāng)氨氮達(dá)到一定濃度時(shí)，對(duì)水生生物的生長(zhǎng)、發(fā)育、免疫力等都會(huì)產(chǎn)生一定的影響?？耸显r成蝦對(duì)氨氮具有較強(qiáng)的耐受力，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于體長(zhǎng)在5cm左右的南美白對(duì)蝦(其氨氮和非離子氨氮對(duì)南美白對(duì)蝦的安全濃度分別為2.667mg/L和0.201mg/L)[12]和體長(zhǎng)在2.84～4.27cm的澳大利亞紅螯螯蝦(該蝦對(duì)水中氨氮濃度的耐受性為：48hLC50為118.06mg/L)[13],對(duì)氨氮耐受力的不同可能與蝦的品種、體質(zhì)、不同生長(zhǎng)階段以及實(shí)驗(yàn)環(huán)境的溫度、pH等因素相關(guān)。有文獻(xiàn)表明，水體充氧可以提高水生生物對(duì)氨氮的耐受力。徐勇等[14]研究了正常溶解氧(5.5～6.0mg/L)和過飽和氧(10～12mg/L)條件下亞硝酸鹽和氨氮對(duì)半滑舌鰨急性毒性效應(yīng)。結(jié)果表明,正常溶氧條件下,非離子氨對(duì)半滑舌鰨的48hLC50值和96hLC50值(95%可信限)分別為0.76mg/L(0.64～0.89mg/L)和0.58mg/L(0.48～0.70mg/L);而過飽和氧條件下非離子氨對(duì)半滑舌鰨的48hLC50值和96hLC50值(95%可信限)分別為2.53mg/L(2.42～2.66mg/L)和2.39mg/L(2.31～2.49mg/L)。高溶氧的存在能夠顯著提高水生生物對(duì)氨氮耐受力的現(xiàn)象在中國(guó)對(duì)蝦[15]及大菱鲆[16]的研究中均有發(fā)現(xiàn)。

[1]董衛(wèi)軍,李 銘,徐加元,等.克氏原螯蝦繁殖生物學(xué)的研究[J].水利漁業(yè),2007，(6):27-104.

[2]李 銘,董衛(wèi)軍,邢迎春,等.溫度對(duì)克氏原螯蝦幼蝦發(fā)育和存活的影響[J].水利漁業(yè),2006，(2):36-37.

[3]蘇時(shí)萍,施培松,楊啟超,等.飼料蛋白質(zhì)水平對(duì)克氏原螯蝦幼體消化酶活性和肌肉成分的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2009，(2):231-235.

[4]唐建清,宋勝磊,潘建林,等.克氏原螯蝦對(duì)幾種人工洞穴的選擇性[J].水產(chǎn)科學(xué)，2004，(5):26-28.

[5]羅靜波,曹志華,蔡太銳,等.氨氮對(duì)克氏原螯蝦幼蝦的急性毒性研究[J].長(zhǎng)江大學(xué)學(xué)報(bào)(自科版)農(nóng)學(xué)卷,2006,(4):183-185.

[6]於葉兵,陸 偉,黃金田,等.亞硝酸鹽和硫化物對(duì)克氏原螯蝦幼蝦的毒性效應(yīng)研究[J].水生態(tài)學(xué)雜志,2011,(1):111-114.

[7]譚 蘋.應(yīng)用Excel軟件計(jì)算半數(shù)致死量[J].山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào).2010，(10):914-916.

[8]于 波,徐成剛,王 青.利用EXCEL求算水中非離子氨[J].重慶環(huán)境科學(xué),2002,21(5):74-75.

[9]孫建軍,丁美麗.氨氮對(duì)中國(guó)對(duì)蝦抗病力的影響[J].海洋與湖沼,1999,30(3):267-272.

[10]Le Moullac G,Haffner P.Environmental factors affecting immune responses in crustacea[J].Aquleulture,2000，191:121-131.

[11]王文琪,姜令緒,寧 楊,等.氨氮對(duì)菲律賓蛤仔免疫力的影響[J].海洋科學(xué),2007,31(1):23-27.

[12]孫國(guó)銘,湯建華,仲霞銘.氨氮和亞硝酸氮對(duì)南美白對(duì)蝦的毒性研究[J].水產(chǎn)養(yǎng)殖,2002，(1):23-25.

[13]陳孝煊,吳志新,熊 波.澳大利亞紅螯螯蝦對(duì)水中氨氮濃度耐受性的研究[J].水產(chǎn)科技情報(bào),1995,22(1):14-16.

[14]徐 勇,張修峰,曲克明,等.不同溶氧條件下亞硝酸鹽和氨氮對(duì)半滑舌鰨的急性毒性效應(yīng)[J].海洋水產(chǎn)研究,2006,27(5):28-33.

[15]王 娟,曲克明,劉海英,等.不同溶氧條件下亞硝酸鹽和氨氮對(duì)中國(guó)對(duì)蝦的急性毒性效應(yīng)[J].海洋水產(chǎn)研究,2007,28(6):1-6.

[16]曲克明,徐 勇,馬紹賽,等.不同溶解氧條件下亞硝酸鹽和非離子氨對(duì)大菱鲆的急性毒性效應(yīng)[J].海洋水產(chǎn)研究,2007,28(4):83-88.

[17]陳金鳳,黃鶴忠,徐汗富,等.氨氮對(duì)文蛤存活及能量收支的影響[J].海洋科學(xué),2010,34(2):40-46.

2013-07-20

山東省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2010GCG20901) 。

鐘君偉(1984-),男,碩士,助理研究員,主要從事水產(chǎn)動(dòng)物病原學(xué)與免疫學(xué)研究。

[作者簡(jiǎn)介]朱永安，E-mail：zhuyongan1965@163.com。

X503.225

A

1673-1409(2013)23-0055-05