李園園，彭廷文，呂玉紅 ，保玉心，邵美云，羅顯濤，曾令榮，岳昌武

(1. 遵義醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)與生物學(xué)研究中心暨貴州省特色微生物資源及藥物開發(fā)重點(diǎn)實驗室，貴州 遵義 563099； 2. 遵義醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，貴州 遵義 563099； 3. 遵義醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州 遵義 563099)

貴州5種藥用植物內(nèi)生菌的分離及次級代謝產(chǎn)物研究

李園園1,2，彭廷文2，呂玉紅3，保玉心1，邵美云1，羅顯濤2，曾令榮2，岳昌武1

(1. 遵義醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)與生物學(xué)研究中心暨貴州省特色微生物資源及藥物開發(fā)重點(diǎn)實驗室，貴州 遵義 563099； 2. 遵義醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，貴州 遵義 563099； 3. 遵義醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州 遵義 563099)

目的分離篩選具有抗菌活性及抗腫瘤活性的藥用植物內(nèi)生菌。方法采集貴州地道藥用植物大黃、刺梨、杜仲、白芍和刺五加等5種組織材料，經(jīng)表面消毒、無菌勻漿后，用改良的GYM培養(yǎng)基和TWYE培養(yǎng)基進(jìn)行分離，利用耐藥大腸桿菌、耐藥金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌及白色鏈球菌等測試菌和稻瘟霉模型對分離菌株的發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行篩選，并通過HPLC對活性菌株發(fā)酵產(chǎn)物做進(jìn)一步分析。結(jié)果分離得到植物內(nèi)生菌180株，其中46株有不同程度的抗菌活性，占分離菌株總數(shù)的25.6%，58株菌有不同程度的抗稻瘟霉活性，占分離菌株總數(shù)的32.2%。結(jié)論5種藥用植物中內(nèi)生菌種類極其豐富，且有活性的菌株所占比例較高，HPLC檢測有新的紫外吸收峰，值得對其次級代謝產(chǎn)物進(jìn)一步研究。可見貴州藥用植物具有豐富的活性內(nèi)生菌資源，有巨大的開發(fā)研究價值。

藥用植物； 內(nèi)生菌； 發(fā)酵產(chǎn)物；抗菌活性； 抗腫瘤活性

植物內(nèi)生菌(endophyte)是指一生或部分時間植物體內(nèi)寄生或共生,并且不會對宿主植物造成明顯傷害的一類微生物,包括細(xì)菌、放線菌、真菌等。自1993年Stierle等[1-2]從短枝紅豆杉中發(fā)現(xiàn)產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌并證明內(nèi)生菌可以合成與宿主植物相似或相同的活性物質(zhì)以來，有關(guān)內(nèi)生菌的研究引起了越來越多研究者的興趣，Kumar等[3]從余干果中分離出5株放線菌，其中有兩株具有抗菌活性，Vigay等[4]從印度苦楝樹中分離出的55株菌中有60%表現(xiàn)出抗菌活性，S.Shweta 等[5]從 Miquelia dentata Bedd 中分離出能產(chǎn)生抗癌劑喜樹堿的內(nèi)生菌。很多的植物內(nèi)生菌的次級代謝產(chǎn)物為生物堿、萜類化合物、黃酮類化合物、甾類化合物等化合物，其中多數(shù)為抗生素、抗癌劑、生物防治劑等，因此利用植物內(nèi)生菌篩選抗生素意義重大[6-7]。

貴州擁有豐富的藥用植物資源，據(jù)初步研究，平均每種藥用植物有5種以上的內(nèi)生菌[8]，因此貴州的藥用植物內(nèi)生菌將是一個巨大的資源庫，值得進(jìn)一步開發(fā)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品的采集 干大黃和杜仲采自務(wù)川縣境內(nèi)，白芍、刺五加根采自鳳崗縣，生大黃根采自仁懷市茅臺鎮(zhèn)，刺梨根和莖采自貞豐縣。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑 改良自來水酵母瓊脂(TWYE)：酵母浸汁0.25 g，K2HPO40.5 g，瓊脂18 g，植物汁50 mL，自來水補(bǔ)足到1000 mL[9];改良GYM：葡萄糖4 g，酵母抽提物4 g，麥芽抽提物10 g，CaCO32 g，瓊脂粉15 g，植物汁50 mL，純水補(bǔ)足到1 000 mL。植物汁：飽漿嫩玉米1 000 g、胡蘿卜200 g和桔子200 g，棄去玉米核和桔子皮，加200 mL自來水全部打勻成漿液后用雙層紗布過濾，濾液加水定容至1 000 mL。用0.22 μm的濾膜過濾除菌后4 ℃保存。麥芽抽提物和瓊脂粉均購自Solarbio公司，葡萄糖購自天津市科密歐試劑有限公司，無水乙醇、甲醇、丙三醇、碳酸鈣等購自成都科龍化工試劑廠。

1.1.3 抑制劑 重鉻酸鉀50 mg/L，制霉菌素20 mg/L，萘啶酮酸20 mg/L，放線菌酮50 mg/L。

1.1.4 測活菌株 耐藥金黃葡萄球菌(Staphylococcusaureussubsp.aureusDSM 1104)、白色鏈球菌(Streptococcus)、耐藥大腸桿菌(E.coliDSM 1103)、藤黃微球菌(MicrococcusluteusCGMCC 1.215 6 )，菌株均來自本實驗室保藏。

1.2 內(nèi)生菌的分離及純化

1.2.1 植物表面消毒 植物組織用自來水沖洗30 min，95%乙醇浸泡5 min，無菌水漂洗后用活性氯含量為1.1%的次氯酸鈉浸泡5 min，無菌水漂洗兩次，每次5分鐘，最后用無菌水沖洗5次，取100 μL最后一次沖洗樣品的水涂布于分離培養(yǎng)基作對照以確證表面消毒徹底。

1.2.2 菌株分離 無菌操作下勻漿或粉碎植物組織后稱取2 g漿液或粉末，加無菌水至10 mL混勻，依次利用無菌水進(jìn)行10、100、1 000倍稀釋。分別取上述稀釋液200 μL涂布于加入抑制劑的分離培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)，挑取單菌株進(jìn)行純化，純化后的菌株接種GYM培養(yǎng)基上。

1.3 活性測定

1.3.1 抗菌活性測定 將測試菌接種于LB液體培養(yǎng)基，37 ℃搖床200 rpm培養(yǎng)6～8 h，取10 mL菌液與200 mL將凝固(約40 ℃)固體LB培養(yǎng)基混合均勻后迅速倒板，凝固后用無菌打孔器挖取直徑4 mm帶有分離菌株菌體的培養(yǎng)基塊放置在測活培養(yǎng)基上，37 ℃正置培養(yǎng)8 h后根據(jù)抑菌圈的有無和直徑大小為依據(jù)判斷抑菌效果。

1.3.2 抗腫瘤活性測定 本實驗中用稻瘟霉模型對菌株進(jìn)行抗腫瘤活性初步篩選[10]。將稻瘟霉接種于PDA斜面培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)12～14 d，無菌棉簽收集孢子并計數(shù)，沙氏液體培養(yǎng)基稀釋孢子至終濃度為7000個/mL，于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板的A1～A12孔中分別加入孢子懸浮液20 μL、沙氏培養(yǎng)基20 μL和無菌水10μL，剩余各孔分別加入孢子懸浮液10 μL、沙氏培養(yǎng)基10 μL及無菌水至30 μL。在A1～A11孔中分別加入50 μL菌株發(fā)酵抽提物，A12孔中加入50 μL無菌水為空白對照。自B1～B12以后每行的菌株發(fā)酵抽提物的濃度依次為前1行的50%進(jìn)行等比稀釋，28 ℃培養(yǎng)20 h，顯微鏡下觀察發(fā)酵產(chǎn)物對孢子萌發(fā)和菌絲體發(fā)育影響。

1.4 產(chǎn)物制備

1.4.1 菌株發(fā)酵 將活性菌株接種于含GYM固體培養(yǎng)基表面，28 ℃培養(yǎng)7 d后，無菌操作下將培養(yǎng)基搗碎，28 ℃繼續(xù)培養(yǎng)7 d。

1.4.2 發(fā)酵產(chǎn)物抽提：發(fā)酵三角瓶中分別加入50 mL乙酸乙酯， 150 rpm，振蕩抽提30 min，雙層濾紙過濾除去菌絲體及固體培養(yǎng)基，濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干，1 mL甲醇溶解產(chǎn)物，抽提物12000 rpm離心10 min備用。

1.5 發(fā)酵產(chǎn)物的HPLC檢測 色譜條件：色譜條件：C18反相色譜柱，進(jìn)樣量20 μL，流速1 mL/min，甲醇:水(80∶20)梯度洗脫。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離結(jié)果 5種植物中，分離得到菌株最多的是刺梨(72株)，最少的是石斛(5株)。不同的培養(yǎng)基總體分離結(jié)果比較，GYM培養(yǎng)基出菌率高于TWYE培養(yǎng)基，結(jié)果(見表1)。

表1菌株分離結(jié)果

培養(yǎng)基杜仲刺梨白芍刺五加大黃石斛合計GYM185982374119TWYE813161013161合計26722433205180

2.2 抗菌活性測試結(jié)果 分離的134株菌的抗菌活性測定結(jié)果(見表2)，共46株分別對不同測活菌表現(xiàn)出不同程度的抑制作用，占34.33%。其中38株對耐藥大腸桿菌有不同程度的殺滅作用(見圖1)，45株對藤黃微球菌有不同程度的殺滅作用，1株對耐藥金黃色葡萄球菌有殺滅作用，1株對白色念球菌有殺滅作用，分別占活性菌株總數(shù)的82.61%、97.83%、2.17%和2.17%。

表2分離菌株抗菌活性測定結(jié)果

菌株 E.coliDSM1103MicrococcusluteusCGMCC1.2156Staphylococcusaureussubsp.aureusDSM1104StreptococcusCWJ-069++++++++--CWJ-082++++++++--CWJ-094++++--CWJ-092+++++++--CWJ-032-++--CWJ-064-+--CWJ-040-+--CWJ-057++++++++--CLG-137-++++--CLG-045++++++--CLG-086+---CLG-096-++--CLG-124++++++--CLG-032+++++--CLG-077-++++--CLG-006++--CLG-016-+++--CLG-119+++++--CLG-106+++--CLG-138+++++--CLG-017+++++++--DH-009-++++--

(續(xù)表)

注：CLJ：刺梨莖；CLG：刺梨根；CWJ：刺五加；BS：白芍；DZ：杜仲；DH：大黃。

注：1：CWJ-069； 2：DH-009；3： DH-005；4：DH-019；5： DH-014；6：DH-018；7：DH-028；8： DH-007；9：DH-034；10：CLG-045；11：CLJ-017；12：BS-014；13：CLG-124；14：CLJ-011；15：CLJ-034；16：WJ-082；17：CWJ-094；18：CWJ-092；19：BS-024；20：BS-036；21：BS-038；22：BS-005；23：CWJ-057；24：CLG-119；25：CLG-138；26：CLG-017；27：DZ-014；28：DZ-028； 29：DZ-018；30：DZ-029；31：DZ-035。 圖1 菌株對耐藥大腸桿菌活性

2.3 抗腫瘤活性測試結(jié)果 抗腫瘤活性稻瘟霉模型初步篩選的180株菌株中(見表1)，有58株能抑制孢子萌發(fā)，占32.22%。其中46株能高度抑制孢子萌發(fā)，12株輕微抑制孢子萌發(fā)。

注：1：CWJ-069；2：CLG-137； 3：DH-009；4：DH-005；5：DH-019；6：DH-014；7：DH-018；8：DH-028；9： DH-007；10： DH-034；11：CLG-045；12：CLJ-017；13：CLG-096；14：CLG-124；15：CLG-032；16：CLG-077；17：CLJ-011；18：CLJ-034；19：CWJ-082；20：CWJ-094； 21：CWJ-092；22：DZ-005；23：BS-024；24：BS-025； 25：BS-036； 26：BS-038；27：BS-005；28：CWJ-032；29：CWJ-064；30：CWJ-057；31：CLG-016；32：CLG-119；33：CLG-106；34：CLG-138；35：CLG-017；36：DZ-014；37：DZ-028；38：DZ-024；39：DZ-018；40：DZ-029；41：DZ-035 圖2 菌株對藤黃微球菌活性

表3抗腫瘤活性測定結(jié)果

菌株抑制程度編號抑制程度編號抑制程度編號抑制程度DZ-043++++CLG-124++++CLG-006++++CWJ-092++++DZ-014++++CLG-138++++DH-004++++CWJ-073++++DZ-024++CLG-119++++BS-011++CLJ-017++++DZ-28++++CLG-062++BS-036++++CLJ-011++++DZ-007++++CLG-065++++BS-024++++CLJ-002++++DZ-029++++CLG-122++++BS-026++++CLJ-032++DZ-030++++CLG-045++BS-014++++CLJ-040++DZ-018++++CLG-058++++BS-020++++CLJ-034++++DZ-035++++CLG-006++++BS-005++++DH-007++++DZ-005++++CLG-109++BS-041++++DH-005++++DZ-023++++CLG-016++++BS-030++DH-028++++DZ-036++++CLG-096++BS-010++++DH-034++++DZ-002++++CLG-100++CWJ-027++SH-007++++DZ-037++CLG-101++CWJ-023++++CLG-042++CLG-014++++CWJ-013++++

注：CLJ：刺梨莖；CLG：刺梨根；CWJ：刺五加；BS：白芍；DZ：杜仲； SH：石斛。

2.4 活性菌株發(fā)酵產(chǎn)物HPLC分析 菌株的發(fā)酵產(chǎn)物大多有較多新的紫外吸收峰，取波長為220 nm、254 nm和300 nm的峰進(jìn)行初步分析，選取菌株活性較好且有較多新的紫外吸收峰的菌株BS-005、CLG-017和CLG-106做進(jìn)一步研究。

3 討論

貴州省藥用植物生物多樣性極其豐富，但是對于其的開發(fā)力度還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，藥用植物內(nèi)生菌能夠產(chǎn)生多種生物活性物質(zhì)，甚至能產(chǎn)生與宿主植物成分類似的代謝產(chǎn)物，從而為篩選和開發(fā)新的天然產(chǎn)物提供了豐富的資源。本研究所分離的菌株中，大部分均具有抗菌或抗腫瘤活性，具有潛在的應(yīng)用價值，在抗稻瘟霉模型中，32.22%對孢子萌發(fā)具有不同程度的抑制作用，并且部分HPLC檢測中有新的紫外吸收峰，可能為新的化合物。其中白芍和刺梨分離得到的菌株BS-005、CLG-017和CLG-106的活性較好且發(fā)酵產(chǎn)物有較多新的吸收峰，后續(xù)將對其結(jié)構(gòu)和生物活性做進(jìn)一步研究，并對其與宿主次級代謝產(chǎn)物之間的活性的關(guān)系做進(jìn)一步研究，對于所分離得到菌株的類型也有待通過提取基因組DNA進(jìn)行16 s鑒定。在分離得到的180株菌株中，刺梨分離得到的菌株最多，其次是刺五加，金釵石斛分離得到的菌株僅為5株；在總體結(jié)果看來，本研究設(shè)計的兩種分離培養(yǎng)基中，GYM培養(yǎng)基的分離效果明顯高于自來水酵母瓊脂?？鼓[瘤活性稻瘟霉模型篩選中，僅發(fā)現(xiàn)抑制稻瘟霉孢子萌發(fā)，未發(fā)現(xiàn)使稻瘟霉孢子發(fā)育的菌絲致畸作用，沒有達(dá)到預(yù)期目的，故菌株的抗腫瘤活性篩選有待進(jìn)一步改進(jìn)實驗流程后繼續(xù)研究。

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IsolationoftheEndophyticbacteriaofseveralmedcinalplantsfromGuizhouprovinceandthestudyoftheirantibacterialandantineoplasticactivity

Liyuanyuan1,2,Pengtingwen2,Lvyuhong3,Baoyuxin1,Shaomeiyun1,Luoxiantao2,Zenglingrong2,Yuechangwu1

( 1.Research Center for Medicine Biology, Zunyi Medical University, Guizhou Key Laboratory of Characteristic Microbial Resources & Drug Development, Guizhou Zunyi 563099, China; 2. Pharmacy School of Zunyi Medical University, Guizhou Zunyi 563099, China; 3. Department of Basic Chemistry, Zunyi Medical University,Guizhou Zunyi 563099,China)

ObjectiveTo isolate and screen Endophytic bacteria those manifest antibacterial activity and antineoplastic activity.MethodsThe tissues of medicinal plants including Radix et Rhizoma Rhei，Roxburgh Rose, Eucommia ulmoides,Oliver, Radix Paeoniae Alba, Radix et Caulis Acanthopanacis Santicosi were collected from Guizhou Province. Endophytic bacteria were isolated by GYM medium and TWYE medium after sterilized and homogenized. The antibacterial activity of fermentation products of all Endophytic bacteria isolated were screened by the test strains ofE.coliDSM 1103,Streptococcus,StaphylococcusaureussubspaureusDSM 1104 andMicrococcusluteusCGMCC 1.2156 and antineoplastic activity were screened by the model of Pyricularia oryzae. Further study about the fermentation products were did by HPLC.Results134 strains were isolated. 46 of them (34.33%) manifest different antibacterial activity，and 58 strains (32.22%) manifest different antineopolastic activities.ConclusionThe Endophytic bacteria of the 5 medicinal plants are very rich and have good antibacterial activity and antineoplastic activity. They are candidates of the study to develop new antibacterial and antineoplastic drugs.

madicinal plants；endophytic actinomycetes；fermentation products；antibacterial activity；antineoplastic activity

國家自然科學(xué)基金項目(NO：31160004);貴州省教育廳特色重點(diǎn)實驗室建設(shè)項目(NO:黔教合KY字[2012]011);貴州省科技學(xué)技術(shù)基金項目(NO：黔科合J字[2010]2156);(NO：黔科合J字[2012]2348);(NO：黔科合SY字[2013]3013)。

岳昌武，男，博士，副研究員，碩士生導(dǎo)師，研究方向：微生物天然產(chǎn)物生物合成，E-mail:changwuyue@126.com。

Q93

A

1000-2715(2013)05-0432-05

[收稿2013-06-08;修回2013-08-24]

(編輯：譚秀榮)