陳 ，郜俊清，金惠根，劉宗軍，趙德強

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院心內(nèi)科，上海 200062)

補氣化痰方對氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞損傷的保護作用

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院心內(nèi)科，上海 200062)

目的：研究補氣化痰方對氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞損傷后的影響及可能的機制。方法：將經(jīng)氧化低密度脂蛋白損傷血管內(nèi)皮細胞分為5組：補氣化痰方藥物血清低、中、高劑量組，模型組和正常對照組。用MTT法觀察補氣化痰方藥物血清對經(jīng)氧化低密度脂蛋白損傷血管內(nèi)皮細胞抑制作用的保護；采用westernblot檢測法測定細胞VEGF蛋白水平探討其可能的機制。結(jié)果：補氣化痰方藥物血清能減少經(jīng)氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞損傷生長的抑制，并通過上調(diào)VEGF蛋白途徑達到抑制氧化低密度脂蛋白對血管內(nèi)皮細胞的損傷。結(jié)論： 補氣化痰方對氧化低密度脂蛋白導(dǎo)致對血管內(nèi)皮細胞損傷有保護作用，其可能的機制是上調(diào)VEGF蛋白表達實現(xiàn)。

補氣化痰方；瓜蔞薤白半夏湯；氧化低密度脂蛋白；血管內(nèi)皮細胞；VEGF

血脂代謝紊亂其中低密度脂蛋白(LDL)的上升是動脈硬化形成的主要因素,低密度脂蛋白經(jīng)過氧化修飾后，將生成氧化低密度脂蛋白(OXLDL),氧化低密度脂蛋白與低密度脂蛋白相比具有更強的致動脈粥樣硬化的作用。一些研究證實，氧化低密度脂蛋白能夠通過細胞凋亡的途徑誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞死亡[1-5]。張仲景的《金匱要略》中論到，瓜蔞薤白半夏湯主要治療痰盛瘀阻型胸痹，而心肌梗死真心痛，其病機多為氣虛，并兼有痰濁瘀阻，故課題組在經(jīng)典方的基礎(chǔ)上，增加了黃芪，補氣用以行氣，使經(jīng)典方既擁有化痰祛邪的作用，又兼顧補氣扶正的作用。研究顯示，黃芪能夠促進血管內(nèi)皮細胞增殖，瓜蔞薤白半夏湯能夠增加血管內(nèi)皮細胞生物學(xué)活性。本研究觀察補氣化痰方對氧化低密度脂蛋白對血管內(nèi)皮細胞損傷是否具有保護作用及可能存在的機制。

1 材料與儀器

1.1 血管內(nèi)皮細胞采用豬髂動脈內(nèi)皮細胞株(PIEC)，來自中國科學(xué)院上海分院細胞所提供；氧化低密度脂蛋白，由上海亞培生物有限公司提供；補氣化痰方：黃芪、瓜蔞、半夏、薤白，經(jīng)過大火煮沸后再用小火繼續(xù)燒20min，將藥液燒至約100mL，再依照不同分組濃度為正常人使用劑量的2、4、8倍，根據(jù)大鼠與人體體表面轉(zhuǎn)換，大鼠需要服藥劑量為0.9mL/100g。

1.2 動物清潔級SD大鼠共20只，8～12周齡，雄性，體質(zhì)量約(250±30)g。動物飼養(yǎng)按照動物倫理委員會相關(guān)規(guī)定。

1.3 主要試劑MTT，由sigma公司提供；細胞培養(yǎng)液DMEN(高糖)，由GIBCOE公司提供；細胞裂解液，由碧云天生物公司提供；VEGF一抗，由Stressgen公司提供；Westernblot二抗，由sigma公司提供；封閉液，由碧云天生物公司提供。

1.4 主要設(shè)備分光光度計bio-photometer，由eppendorf公司提供；酶聯(lián)免疫檢測儀Model680，由BIO-RAD公司提供；高速離心機centrifuge5804R，由eppendorf公司提供；低速離心機centrifuge5702，由eppendorf公司提供。

2 方法

2.1 藥物血清制備 雄性SD大鼠80只，隨機分為補氣化痰高、中、低劑量組和空白對照組，每組20只，補氣化痰方組按照分組要求給予灌胃(藥物使用量等同于臨床用量的2、4、8倍)，對照組進行等體積的0.9%氯化鈉灌胃，1d給藥2次，共5d，最后一次灌胃前不禁水、禁食12h。末次給藥后1h，腹腔注射2.5%戊巴比妥鈉麻醉，無菌條件下分離腹主動脈取血，靜置血液2h，再經(jīng)過3 000r/min離心10min，取離心上清液3mL左右，56 ℃水浴滅活30min，用微孔濾膜0.22μm除菌，分裝，-20 ℃進行凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 培養(yǎng)液的配制 將10gDMEN干粉加入900mL三蒸水中，再加入10mL雙抗，并加入NaHCO3，HEPES，用0.22μm微孔濾膜除菌。

2.3 細胞的傳代 血管內(nèi)皮細胞采用已配制好的10%高糖DMEN培養(yǎng),在37 ℃、5%CO2飽和濕度的條件下培養(yǎng)。干預(yù)時在細胞未對數(shù)生長期時，將細胞懸液依照1:2速率傳代細胞。

2.4 實驗分組 1)對照組(正常鼠血清培養(yǎng)液)；2)模型組(正常鼠血清培養(yǎng)液+200μg/mLOXLDL)；3)治療組：不同劑量含藥鼠血清培養(yǎng)液+200μg/mLOXLDL。

2.5 細胞處理當(dāng)血管內(nèi)皮細胞生長至80%,用0.25%胰酶進行消化，在血球板上進行細胞計數(shù)，將血管內(nèi)皮細胞懸液濃度調(diào)整到5×104個/mL。將細胞接種到96孔培養(yǎng)板中,每孔中加入100μL細胞懸液。培養(yǎng)12h后，根據(jù)分組加入不同鼠血清培養(yǎng)液200μL。培養(yǎng)2h后在培養(yǎng)孔中加入OXLDL使其在治療組及模型組的藥物終末濃度為200μg/mL。

2.6 不同濃度的補氣化痰方對經(jīng)氧化低密度脂蛋白損傷血管內(nèi)皮細胞生長的影響 將血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)2d，每組重復(fù)5孔，加入MTT，4h后，加入DMSO混勻，測定540nm波長處的吸光值(OD值)。

2.7 補氣化痰方對OXLDL損傷PIEC后細胞內(nèi)VEGF的表達 將經(jīng)過處理的細胞培養(yǎng)48h后,將400μL含PMSF的裂解液加入每瓶細胞中，然后將液體移至離心管中，經(jīng)過4 ℃、12 000r/min離心5min，取上清液分裝于EP管中。提取蛋白，取40μg蛋白上樣進行電泳，待溴酚蘭剛跑出即可終止電泳，進行轉(zhuǎn)膜。分別進行一抗及二抗反應(yīng)。最后在暗室中顯影、定影，晾干。凝膠圖象分析。

3 結(jié)果

3.1 各種濃度的補氣化痰方對經(jīng)氧化低密度脂蛋白損傷大鼠血管內(nèi)皮細胞后生長的影響 補氣化痰方在10%血清下能有效抑制OXLDL對血管內(nèi)皮細胞生長的抑制作用,在3個不同劑量濃度范圍內(nèi)其濃度與抑制作用呈正線性相關(guān)，圖1。

在相同時間條件下，與模型組比較#P<0.05。 圖1 不同濃度補氣化痰方對經(jīng)OXLDL損傷大鼠血管內(nèi)皮細胞后生長的影響

圖2 補氣化痰方對經(jīng)OXLDL損傷PIEC后VEGF蛋白的影響

圖3 補氣化痰方對經(jīng)OXLDL損傷PIEC后VEGF蛋白的影響

3.2 補氣化痰方對OXLDL損傷PIEC后細胞內(nèi)VEGF的表達 經(jīng)過OXLDL損傷后的血管內(nèi)皮細胞，其抑凋亡蛋白Bcl-2呈現(xiàn)高表達，促凋亡蛋白BAX呈現(xiàn)低表達，但是經(jīng)含補氣化痰方藥物血清預(yù)處理過后，BAX表達明顯下調(diào)，Bcl-2表達明顯上調(diào)(P<0.05)，見圖2、圖3。

4 討論

冠心病在《黃帝內(nèi)經(jīng)》中就有記載。中醫(yī)稱冠心病為胸痹，在患者癥狀方面有記載，《素問·藏氣法時論篇》說：“心病者，胸中痛，脅支滿，脅下痛，膺背肩胛間痛，兩臂內(nèi)痛?！睂χ匕Y胸痹患者，《靈樞·厥論》篇指出：“真心痛，手足青至節(jié)，心痛甚，旦發(fā)夕死，夕發(fā)旦死?！?/p>

LDL升高是血管動脈粥樣硬化形成的主要因素，低密度脂蛋白經(jīng)過氧化作用后，轉(zhuǎn)變成為氧化低密度脂蛋白(OXLDL)，氧化低密度脂蛋白具有較低密度脂蛋白更強的致動脈粥樣硬化的作用。一些研究證實，氧化低密度脂蛋白能夠通過細胞凋亡的途徑誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞死亡[1-5]。目前研究顯示，胸痹冠心病病機多為氣虛、痰濁、血瘀[6-8]。張仲景《金匱要略》中瓜蔞薤白半夏湯主要治療痰盛瘀阻型胸痹。心肌梗死真心痛病機特點多為氣虛，也兼有痰濁瘀阻，故課題組在經(jīng)典方的基礎(chǔ)上，增加黃芪補氣藥物，主要為了補氣以行氣，使金匱要略經(jīng)典組方既具備化痰祛邪的作用，又具有補氣扶正的作用。近期研究[9-11]顯示，瓜蔞薤白半夏湯能改善冠狀動脈內(nèi)皮的功能，以達到減少心肌損傷，并可改善缺血引起心絞痛的癥狀，并有降低血脂作用。本研究在金匱要略經(jīng)典方基礎(chǔ)上，大劑量使用補氣藥物黃芪，旨在補氣以行氣，祛邪兼扶正。

本研究顯示，補氣化痰方能抑制氧化低密度脂蛋白對血管內(nèi)皮細胞生長的抑制，在一定劑量范圍內(nèi)呈劑量依賴性。高劑量補氣化痰方能顯著減輕經(jīng)OXLDL對血管內(nèi)皮細胞生長的抑制，這一作用可能是通過調(diào)控凋亡調(diào)節(jié)蛋白的作用達到。BCL-2是一種抑制凋亡過程的蛋白,而BAX是一種促進凋亡過程的蛋白[12-13]。補氣化痰方可通過上調(diào)BCL-2凋亡抑制蛋白及下調(diào)BAX凋亡促進蛋白表達來實現(xiàn)對氧化低密度脂蛋白對豬髂動脈血管內(nèi)皮細胞損傷的抑制作用。

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R543.1

A

1003-5699(2013)06-0612-03

國家中醫(yī)藥管理局重點?？平ㄔO(shè)項目課題(2011Z059)。

*[通信作者] 趙德強，Tel:13816985971,E-mail:kevingjq@163.com。

2013-01-16)