白 巍，張海平

離心運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠骨骼肌線粒體ATP酶活性及desmin表達(dá)影響的研究

白 巍，張海平

（沈陽體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)人體科學(xué)學(xué)院，遼寧沈陽110102）

目的：從細(xì)胞內(nèi)線粒體Ca2＋轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)入手，探討離心運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠骨骼肌細(xì)胞線粒體ATP酶活性及desmin表達(dá)影響，以期進(jìn)一步揭示骨骼肌運(yùn)動(dòng)性損傷的發(fā)生機(jī)制。方法：雄性SD大鼠96只，體重304g±12g，隨機(jī)分為安靜對(duì)照組、運(yùn)動(dòng)后即刻組、運(yùn)動(dòng)后12h組、運(yùn)動(dòng)后24h組、運(yùn)動(dòng)后48h組、運(yùn)動(dòng)后72h組、運(yùn)動(dòng)后5d組、運(yùn)動(dòng)后7d組。采用一次性下坡跑訓(xùn)練建立運(yùn)動(dòng)損傷模型，取大鼠肱三頭肌，部分肌肉做desmin免疫組化切片，并進(jìn)行定量分析；余下肌肉差速離心提取線粒體，測(cè)定線粒體各ATP酶活性。結(jié)果：1）離心運(yùn)動(dòng)后大鼠骨骼肌desmin表達(dá)從運(yùn)動(dòng)后即刻到24h呈逐漸下降的趨勢(shì)，以運(yùn)動(dòng)后24h下降最為明顯，48h開始回升，第5d達(dá)到最高，第7d略有下降，但仍明顯高于安靜對(duì)照組。2）離心運(yùn)動(dòng)后即刻大鼠骨骼肌細(xì)胞線粒體Ca2＋－ATPase、Ca2＋－Mg2＋－ATPase和Na＋－K＋－ATPase的活性顯著下降，12h、24h酶活性有所恢復(fù)，仍然明顯低于安靜對(duì)照組；48h后各ATP酶結(jié)果與安靜對(duì)照組均無顯著差異。結(jié)論：大鼠離心運(yùn)動(dòng)后骨骼肌細(xì)胞線粒體ATP酶活性變化與desmin表達(dá)之間存在著某種密切相關(guān)的聯(lián)系，線粒體鈣調(diào)節(jié)失衡是導(dǎo)致骨骼肌運(yùn)動(dòng)損傷的一個(gè)重要原因；而離心運(yùn)動(dòng)后desmin表達(dá)的變化，對(duì)骨骼肌運(yùn)動(dòng)性損傷形態(tài)學(xué)變化的早期界定和損傷恢復(fù)程度的判斷具有重要的參考價(jià)值。

離心運(yùn)動(dòng)；大鼠骨骼??；線粒體；ATP酶活性；desmin表達(dá)

目前，骨骼肌運(yùn)動(dòng)損傷的機(jī)制有許多學(xué)說，包括代謝學(xué)說和機(jī)械損傷學(xué)說等，但無論哪種學(xué)說，都與骨骼肌細(xì)胞內(nèi)胞漿Ca2＋濃度的變化有關(guān)［1］。在細(xì)胞內(nèi) Ca2＋的調(diào)節(jié)中，線粒體Ca2＋轉(zhuǎn)移系統(tǒng)對(duì)胞內(nèi)Ca2＋起著持久的、大容量的調(diào)節(jié)，而線粒體Ca2＋含量和ATP酶活性的變化與骨骼肌損傷也有著密切的內(nèi)在聯(lián)系。近年來，學(xué)者在探討骨骼肌運(yùn)動(dòng)損傷機(jī)制的基礎(chǔ)上，對(duì)肌肉損傷時(shí)細(xì)胞骨架蛋白的結(jié)構(gòu)變化等進(jìn)行了許多研究［2－3］，越來越多的肌肉病理專家認(rèn)為，了解并掌握骨架蛋白在損傷肌肉中的表達(dá)是深刻理解肌肉損傷病理機(jī)制的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。臨床上，常采用細(xì)胞骨架蛋白來判斷腫瘤組織來源，或是作為不同種肌病的病理分型依據(jù)，而系統(tǒng)的有關(guān)離心運(yùn)動(dòng)后骨架蛋白表達(dá)與線粒體ATP酶活性的相關(guān)研究尚不多見，故本研究對(duì)揭示骨骼肌運(yùn)動(dòng)損傷肌細(xì)胞desmin的表達(dá)規(guī)律及發(fā)生機(jī)制等具有非常重要的意義。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與分組

雄性SD大鼠96只，體重302g±12g，購(gòu)于沈陽醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。大鼠購(gòu)回后，隨機(jī)分為安靜對(duì)照組（con）、運(yùn)動(dòng)后即刻組（oh）、運(yùn)動(dòng)后12小時(shí)組（12h）、運(yùn)動(dòng)后24小時(shí)組（24h）、運(yùn)動(dòng)后48小時(shí)組（48h）、運(yùn)動(dòng)后 72小時(shí)組（72h）、運(yùn)動(dòng)后5天組（5d）、運(yùn)動(dòng)后7天組（7d）。組間動(dòng)物體重?zé)o顯著性差異，實(shí)驗(yàn)前所有動(dòng)物均未進(jìn)行過跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)。實(shí)驗(yàn)室溫度（22±3）℃，相對(duì)濕度50% ～60%，光照時(shí)間：7：00－19：00。

1.2 運(yùn)動(dòng)損傷模型

運(yùn)動(dòng)損傷模型在在沈陽體育學(xué)院國(guó)家體育總局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行，采用一次性下坡跑運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練建立運(yùn)動(dòng)損傷模型［4］。實(shí)驗(yàn)前2天，所有動(dòng)物進(jìn)行5～10min跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，速度為5～10m／min，坡度為0°。實(shí)驗(yàn)時(shí)，所有運(yùn)動(dòng)組動(dòng)物均進(jìn)行持續(xù)性下坡跑，速度為16m／min，坡度為－16°，總運(yùn)動(dòng)時(shí)間為200min，100min運(yùn)動(dòng)結(jié)束后，動(dòng)物休息5min，然后再進(jìn)行100min運(yùn)動(dòng)。

1.3 骨骼肌desmin免疫組化切片制作

骨骼肌desmin免疫組化切片在中國(guó)醫(yī)科大學(xué)免疫組化實(shí)驗(yàn)室完成。大鼠運(yùn)動(dòng)結(jié)束后，各組按不同時(shí)間點(diǎn)，腹腔注射戊巴比妥溶液，劑量為0.25～0.5g／kg體重，取右側(cè)肱三頭肌，制作骨骼肌desmin免疫組化切片，試劑盒采用武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品。每組切片取6張，按對(duì)角線劃分區(qū)域任選取5個(gè)視野，顯微鏡下觀察（×400倍），用 motic image 3.0分析軟件進(jìn)行分析。參數(shù)設(shè)定：目標(biāo)總面積占圖像視場(chǎng)的百分比：目標(biāo)總面積占圖像視場(chǎng)的百分比（%）＝（目標(biāo)總面積÷視野區(qū)域面積）×100%，代表desmin表達(dá)。

1.4 骨骼肌細(xì)胞線粒體制備［1，5］

稱取1.5克肌組織，在冰浴上剪成碎塊，按重量體積1∶4.5的比例加入事先預(yù)冷的0.25M蔗糖－0.01MTris緩沖液，制備成組織勻漿。勻漿液在高速冷凍離心機(jī)內(nèi)經(jīng)差速離心提取線粒體，并置于0.5ml的0.25M蔗糖－0.01MTris緩沖液中待測(cè)。以上步驟均在0～4℃環(huán)境中進(jìn)行。

1.5 大鼠肱三頭肌線粒體ATP酶活性測(cè)定

采用南京建成生物工程研究所提供的超微量ATP酶測(cè)試盒和6010紫外－可見分光光度計(jì)（安捷倫上海分析儀器廠）。樣品取量及吸光度測(cè)定均嚴(yán)格按照試劑盒說明書所示程序進(jìn)行操作。計(jì)算公式：組織中ATPase活力（U／mgprot）＝（測(cè)定管OD值-對(duì)照管OD值）／（標(biāo)準(zhǔn)管OD值-空白管OD值）×標(biāo)準(zhǔn)管濃度（0.02μmol／ml）×6* ×A** ÷蛋白含量（mgprot／ml）。其中公式中：6*：定義上為每小時(shí)，實(shí)際操作為l0分鐘反應(yīng)；A**：代表反應(yīng)體系中稀釋的倍數(shù)，其中Ca2＋－ATPase為2.8倍，Ca2＋－Mg2＋－ATPase、Na＋－K＋－ATPase為7.8倍。

1.6 數(shù)理統(tǒng)計(jì)法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)均進(jìn)行處理，單因素方差分析（ANOVA）進(jìn)行組間差異顯著性檢驗(yàn)，顯著性水平為P＜0.05。

2 研究結(jié)果

2.1 離心運(yùn)動(dòng)后大鼠骨骼肌細(xì)胞desmin表達(dá)影響

表1可以看出，與安靜對(duì)照組相比，離心運(yùn)動(dòng)后大鼠骨骼肌desmin表達(dá)從運(yùn)動(dòng)后即刻到24h呈逐漸下降的趨勢(shì)，以運(yùn)動(dòng)后24h下降最為明顯（P＜0.05）；48h開始回升，到第5d達(dá)到最高，為安靜對(duì)照組的114.70%（P＜0.05）；第7d略有下降，但仍明顯高于安靜對(duì)照組，為安靜對(duì)照組的112.09%（P＜0.05）。

表1 離心運(yùn)動(dòng)后不同時(shí)刻大鼠骨骼肌desmin表達(dá)影響

2.2 離心運(yùn)動(dòng)后大鼠骨骼肌細(xì)胞線粒體ATP酶活性變化

表2可以看出，大鼠骨骼肌細(xì)胞線粒體Ca2＋－ATPase、Ca2＋－Mg2＋－ATPase和 Na＋－K＋－ATPase的活性在離心運(yùn)動(dòng)后即刻即顯著下降（P＜0.01），分別下降了52.31%、36.51%和47.19%；12h、24h酶活性有所恢復(fù)，仍然明顯低于安靜對(duì)照組（P＜0.01）；48h后各 ATP酶結(jié)果（Ca2＋－Mg2＋－ATPase 48h P＜0.05）與安靜對(duì)照組均無顯著差異（P＞0.05），表明ATP酶活性基本恢復(fù)正常。

表2 大鼠離心運(yùn)動(dòng)后不同時(shí)刻骨骼肌細(xì)胞線粒體ATP酶活性變化

3 討論

在骨骼肌細(xì)胞中，desmin為中等徑細(xì)胞骨架纖維，對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的支撐、細(xì)胞形狀的決定及細(xì)胞機(jī)械強(qiáng)度的賦予等有重要作用。高張力的機(jī)械牽拉會(huì)使細(xì)胞骨架的正常結(jié)構(gòu)受到影響，進(jìn)而造成肌肉收縮蛋白的結(jié)構(gòu)破壞［6－8］，而 desmin的丟失被認(rèn)為是骨骼肌運(yùn)動(dòng)性微損傷的一個(gè)較為敏感的形態(tài)學(xué)指標(biāo)［9－10］。Friden等學(xué)者［10］曾對(duì) 6名男選手劇烈運(yùn)動(dòng)后的股外側(cè)肌進(jìn)行了活檢，證明了在劇烈運(yùn)動(dòng)后有大量的desmin表達(dá)。Barash等［11］的研究發(fā)現(xiàn)，大鼠離心收縮后骨骼肌desmin染色下降在離心運(yùn)動(dòng)后12h為最明顯。Lieber等研究也證實(shí)細(xì)胞骨架蛋白的水解是骨骼肌離心收縮損傷的重要原因［12－14］。袁建琴等［15］的研究顯示，骨骼肌 desmin蛋白表達(dá)在運(yùn)動(dòng)后即刻出現(xiàn)顯著性下降，且與超微結(jié)構(gòu)中Z線等變化相似，也表現(xiàn)出延遲性變化的趨勢(shì)。

一般認(rèn)為，離心運(yùn)動(dòng)過程中，骨骼肌desmin的早期丟失是肌節(jié)破壞的證據(jù)，運(yùn)動(dòng)后第2天desmin出現(xiàn)升高，意味著肌原纖維開始重建［16－17］。研究表明，desmin在損傷和再生肌肉中的表達(dá)存在著一定的規(guī)律［18］。在正常肌纖維中，desmin在肌纖維和靜息衛(wèi)星細(xì)胞中有分布；肌肉損傷開始后，desmin表達(dá)下降；2天后，desmin表達(dá)增加；4天后，達(dá)到峰值并持續(xù)到3周之后。從本研究的結(jié)果看，骨骼肌損傷后desmin的表達(dá)從運(yùn)動(dòng)后即刻到24h呈逐漸下降的趨勢(shì)，并以運(yùn)動(dòng)后24h下降最為明顯；48h表達(dá)開始增加，到第5天達(dá)到最高，隨后略有下降，但到第7天仍明顯高于安靜對(duì)照組。結(jié)果表明：離心運(yùn)動(dòng)后即刻骨骼肌即由于機(jī)械的高張力的作用而出現(xiàn)肌纖維損傷，表現(xiàn)出desmin的丟失，也反映了肌節(jié)的破壞，這種破壞以離心運(yùn)動(dòng)后24h最為明顯，48h后desmin表達(dá)開始增加，但24h與48h之間沒有明顯差異，表明desmin的丟失與同期電鏡的超微結(jié)構(gòu)改變是基本一致的，后者表現(xiàn)的肌肉損傷的最嚴(yán)重程度與前者相比略有延遲。desmin的表達(dá)在48h開始增加，第5天達(dá)到最高，第7天略降但仍明顯高于安靜對(duì)照組，表明可能有新的肌節(jié)逐漸生成，也反映骨骼肌損傷后48h已體現(xiàn)出明顯的修復(fù)過程，這與組織損傷的病理變化過程基本相符。

研究發(fā)現(xiàn)，骨骼肌細(xì)胞胞漿內(nèi)Ca2＋增多的程度與肌細(xì)胞損傷的程度成正比［4，19］。田野采用非力竭間歇運(yùn)動(dòng)和力竭性持續(xù)運(yùn)動(dòng)，連續(xù)觀察運(yùn)動(dòng)后線粒體鈣含量的變化，發(fā)現(xiàn)兩種負(fù)荷運(yùn)動(dòng)后線粒體鈣含量的變化趨勢(shì)基本一致，表明運(yùn)動(dòng)后線粒體聚鈣可能與疲勞的發(fā)展密切相關(guān)［4］。周錦林等采用不同強(qiáng)度的跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，發(fā)現(xiàn)股四頭肌和腓腸肌線粒體Ca2＋－ATPase活性在大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后略有變化，中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后顯著下降，表明骨骼肌線粒體Ca2＋－ATPase活性下降可能是造成中等強(qiáng)度長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)動(dòng)后骨骼肌疲勞的原因之一［19］。本研究結(jié)果，大鼠離心運(yùn)動(dòng)后骨骼肌細(xì)胞線粒體ATP酶活性的下降主要出現(xiàn)在運(yùn)動(dòng)后即刻到48h，并以運(yùn)動(dòng)后即刻下降最為明顯，48h后各ATP酶活性基本恢復(fù)正常。ATP酶活性的降低，說明離心性負(fù)荷所致?lián)p傷過程中線粒體鈣超載引起ATP生成減少，提示在骨骼肌損傷中線粒體鈣超載也是細(xì)胞Ca2＋代謝紊亂和細(xì)胞損傷的直接原因。而骨骼肌損傷后desmin表達(dá)從運(yùn)動(dòng)后即刻到24h呈逐漸下降的趨勢(shì)，并以運(yùn)動(dòng)后24h下降最為明顯，顯示大鼠離心運(yùn)動(dòng)后骨骼肌細(xì)胞線粒體ATP酶活性與desmin表達(dá)之間存在著某種密切相關(guān)的聯(lián)系，說明在骨骼肌損傷過程中Ca2＋大量?jī)?nèi)流，造成線粒體鈣超載，過多的鈣抑制線粒體的氧化代謝酶，使線粒體的ATP產(chǎn)生降低，進(jìn)一步使細(xì)胞ATP依賴性離子泵功能下降，細(xì)胞內(nèi)離子調(diào)控功能進(jìn)一步下降，形成惡性循環(huán)；而過多的鈣還可促進(jìn)組織的自由基產(chǎn)生，促進(jìn)脂質(zhì)過氧化，使線粒體及離子泵損傷，進(jìn)而導(dǎo)致或加重骨骼肌損傷。

4 結(jié)論

大鼠離心運(yùn)動(dòng)后骨骼肌細(xì)胞線粒體ATP酶活性變化與desmin表達(dá)之間存在著某種密切相關(guān)的聯(lián)系，線粒體鈣調(diào)節(jié)失衡是導(dǎo)致骨骼肌運(yùn)動(dòng)損傷的一個(gè)重要原因；而離心運(yùn)動(dòng)后desmin表達(dá)的變化，對(duì)骨骼肌運(yùn)動(dòng)性損傷形態(tài)學(xué)變化的早期界定和損傷恢復(fù)程度的判斷具有重要的參考價(jià)值。

［1］魏 源，王 革，卓 莉.運(yùn)動(dòng)性骨骼肌微損傷機(jī)制的研究進(jìn)展［J］.上海體育學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，31（2）：67－73.

［2］Friden J，Lieber R L.Segmental muscle fiber lesions after repetitive eccentric contractions［J］.Cell Tissue Res，1998，293（1）：165－171.

［3］Arnardottir S，Borg K，Ansved T.Sporadic inclusion body myositis：morphology，regeneration，and cytoskeletal structure of muscle fibres［J］.Neurol Neurosurg Psychiatry，2004，75（6）：917－20.

［4］田 野.運(yùn)動(dòng)性線粒體鈣積聚、細(xì)胞脂質(zhì)過氧化對(duì)骨骼肌結(jié)構(gòu)、機(jī)能的影響［D］.北京：北京體育大學(xué)，1991.

［5］Carl SL，F(xiàn)eix K，Caswell A H.Immunolocalization of triadin，DHP receptors in adult and developing skeletal muscle of rats［J］.Muscle＆Nerve，1995，18（11）：1232.

［6］馬 濤，李世昌.細(xì)胞骨架及運(yùn)動(dòng)性骨骼肌微損傷研究進(jìn)展［J］.體育學(xué)刊，2006，13（5）：48－52.

［7］段立公，李國(guó)平，李肅反.結(jié)蛋白和波形蛋白在運(yùn)動(dòng)性肌肉損傷和再生過程中表達(dá)及意義的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)雜志，2001，20（2）：167－170.

［8］高前進(jìn)，李壯志，馬新東，等.骨骼肌細(xì)胞骨架蛋白研究綜述［J］.北京體育大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，28（10）：1382－1385.

［9］Arnardottir S，Borg K，Ansved T.Sporadic inclusion body myositis：morphology，regeneration，and cytoskeletal structure of muscle fibres［J］.Neurol Neurosurg Psychiatry，2004，75（6）：917－20.

［10］Friden J，Kjorell U，Thornell L E.Delayed muscle soreness and cytoskeletal alterations：an immunocytological study in man［J］.Int J Sports Med，1984，5（1）：15－18.

［11］Barash I A，Peters D，F(xiàn)riden J，et al.Desmin cytoskeletal modifications after a bout of eccentric exercise in the rat［J］.Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2002，283（4）：R958－963.

［12］Idenj F R.Segmental muscle fiber lesions after repetition eccentric contractions［J］.Cell T Issue Res，1998，293：165－171.

［13］Brooks SV，Zerba E，F(xiàn)aulkner JA.Injury to muscle fibres after single stretches of passive and maximally stimulated muscles in mice［J］.JPhysiol，1995，488（Pt2）：459－469.

［14］Barash I A，Peters D，F(xiàn)riden J，et al.Desmin cytoskeletal modifications after a bout of eccentric exercise in the rat［J］.Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2002，283（4）：R958－963.

［15］袁建琴.低氧離心運(yùn)動(dòng)對(duì)結(jié)蛋白的分布和表達(dá)的影響［D］.北京：北京體育大學(xué)，2004.

［16］Yu J G，Malm C，Thornell L E.Eccentric contractions leading to DOMSdo not cause loss of desmin nor fibre necrosis in human muscle［J］.Histochem Cell Biol，2002，118（1）：29－34.

［17］Yu JG，F(xiàn)urst D O，Thornell L E.The mode of myofibril remodelling in human skeletal muscle affected by DOMS induced by eccentric contractions［J］.Histochem Cell Biol，2003，119（5）：383－393.

［18］徐玉明，王瑞元.運(yùn)動(dòng)性肌纖維dystrophin、desmin的變化特征［J］.北京體育大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，30（4）：516－518.

［19］周錦琳，田 野.急性運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠骨骼機(jī)線粒體Ca2＋－ATP酶和H＋－ATP酶活性的影響［J］.北京體育大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，24（3）：322－346.

Eccentric Exercise upon Mitochondria ATP Enzymes Activity and Desmin Expression of Skeletal Muscles of Rats

BAI Wei，ZHANG Haiping
（School of Human Sports Science，Shenyang Sport University，Shenyang 110102，Liaoning，China）

Aim：The article studied the influence of eccentric exercise upon mitochondria ATPenzymes activity and desmin expression of skeletal muscles of rats from the angle of Ca2＋transporting system in miotochondria of cell，further discovering the mechanism of exercise-induced muscled damage（EIMD）.Methods：96 SD male rats（weight 304g±12g）were selected as the objects of this study and were randomly divided into groups of peaceful contrast（con）at 0h，12h，24h，48h，72h，5d，7d after exercise according to the time when the rats were killed.The model of injury was a bout of exhaustive eccentric exercise on a treadmill.Triceps brachiies were drawn for the immunohistochemical specimens of desmin and extracting of miotochondria.The immunohistochemical specimens of desmin were analyzed quantitatively under microscope.Miotochondria were extracted by the method of centrifugation at different speed and their activity were measured.Results：1）The expression of desmin of rats’skeletal muscles had a gradual descending tendency from the instant to 24 hour after eccentric exercise，and the descent at 24 hour was the most evident.From 48h，the expression began to increase and reached the top at 5d，then slightly decreased at 7d and its value was higher obviously than that of con.2）The activities of Ca2＋-ATPase，Ca2＋-Mg2＋-ATPase and Na＋-K＋-ATPase in miotochondria decreased obviously from the instant after eccentric exercise，the activities of ATPases of 12h and 24h increased slightly but were still lower obviously than that of con.The activities of ATPases of 48h and later time were not different obviously with that of con.Conclusions：The changes of mitochondria ATPenzyme’s activity were related closely to desmin’s expression of skeletal muscles of rats after eccentric exercise.The unbalance of Ca2＋regulation in mitochondria was an important reason of EIMD.The changes of desmin’s expression after eccentric exercise had a important reference value for the earlier injury diagnosis and the recovery’s judgment of EIMD.

eccentric exercise；skeletal muscles of rats；mitochondria；the activities of ATPases；desmin expression

G804.7

A

1004－0560（2013）02－0086－03

2012-09-07；

2012-11-26

遼寧省教育廳高?？茖W(xué)研究項(xiàng)目（20060850）。

白 ?。?956－），男，副教授，主要研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)解剖學(xué)。

張海平（1964－），男，教授，博士，主要研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)對(duì)骨骼肌形態(tài)和機(jī)能的影響。E－mail：Zhping2000＠126.com。

責(zé)任編輯：?jiǎn)唐G春