郭慶軍， 王桂敏， 張秀秀

(遼寧醫(yī)學(xué)院 1研究生學(xué)院， 2附屬第一醫(yī)院，遼寧 錦州 121000)

淫羊藿苷預(yù)處理對心肌缺血再灌注損傷炎癥反應(yīng)的影響

郭慶軍1， 王桂敏2△， 張秀秀1

(遼寧醫(yī)學(xué)院1研究生學(xué)院，2附屬第一醫(yī)院，遼寧 錦州 121000)

目的觀察淫羊藿苷對心肌缺血再灌注損傷的影響并探討是否存在劑量依賴關(guān)系。方法結(jié)扎大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支30 min，再灌注2 h，建立心肌缺血再灌注模型。將48只體重在250～300 g的健康成年雄性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組，模型組，淫羊藿苷低、中、高劑量組及阿司匹林組。HE染色觀察心肌組織形態(tài)學(xué)改變，免疫組化法檢測 NF-κB p65 蛋白在心肌細(xì)胞核中的表達(dá)，蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測心肌組織中腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)表達(dá)，酶聯(lián)免疫吸附法測定血清白細(xì)胞介素1β(interleukin 1β,IL-1β)含量，比色法檢測心肌組織中髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)活性。結(jié)果與假手術(shù)組比較，其余5組TNF-α表達(dá)及IL-1β濃度升高(P<0.01)，NF-κB表達(dá)增強(qiáng)(P<0.01)，MPO活性增加(P<0.01)；與模型組比較，淫羊藿苷低、中、高劑量組及阿司匹林組TNF-α表達(dá)及IL-1β濃度下降(P<0.05)，NF-κB表達(dá)減弱(P<0.05)，MPO活性降低(P<0.05)； 淫羊藿苷高劑量組與阿司匹林組比較無顯著差異(P>0.05) 。結(jié)論淫羊藿苷預(yù)處理能減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷炎癥反應(yīng)，并且呈現(xiàn)出劑量依賴性。

淫羊藿苷； 心肌缺血; 再灌注損傷； 炎癥

心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia-reperfusion injury, MIRI)是指心肌缺血一定時(shí)間后的動(dòng)脈再通反而會(huì)加重心肌損傷,其原因是在心肌缺血時(shí)心肌細(xì)胞凋亡增加,而隨后的再灌注誘發(fā)的炎癥反應(yīng)又加重了這種結(jié)果。研究發(fā)現(xiàn)炎癥因子水平和缺血后心臟功能的損害程度及心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量直接相關(guān)[1],說明炎癥反應(yīng)在心肌缺血再灌注損傷中起了非常重要的作用。目前心肌缺血再灌注損傷在臨床上是常見的，尋求一種有效可行的方法減輕心肌缺血再灌注損傷，最大限度保護(hù)缺血心肌，限制心肌梗死范圍，是國內(nèi)外學(xué)者探索的目標(biāo)。藥物預(yù)適應(yīng)處理受到醫(yī)學(xué)界的廣泛重視[2]。近年來中藥因其療效穩(wěn)定、毒副作用少、能作用于疾病多個(gè)環(huán)節(jié)等優(yōu)點(diǎn)而受到廣泛重視。

淫羊藿,為小檗科植物淫羊藿(EpimediumbrevicornumMaxim)的全草。淫羊藿的主要化學(xué)成分為黃酮、多糖，淫羊藿苷(icariin)是淫羊藿黃酮中的主要活性成分。豐貴文等[3]研究表明，淫羊藿苷可通過抑制誘導(dǎo)型一氧化氮合酶表達(dá)及其下游的炎癥級聯(lián)反應(yīng)而減輕大鼠腎臟缺血再灌注損傷。蔣毅萍等[4]研究表明，淫羊藿總苷對缺血再灌注損傷大鼠心肌具有保護(hù)作用,其作用機(jī)制與抗氧化自由基作用有關(guān)。然而，目前尚無淫羊藿苷對心肌缺血再灌損傷炎癥反應(yīng)影響的報(bào)道，本研究旨在探索淫羊藿苷對心肌缺血再灌注損傷炎癥反應(yīng)的影響，為淫羊藿苷應(yīng)用于臨床提供理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1材料

1.1主要藥品與試劑 淫羊藿苷(陜西西安飛達(dá)生物技術(shù)有限公司，純度為 98.36%)；阿司匹林(上海靜融生物科技有限公司)；免疫印跡 PVDF 膜(Roche)；兔抗大鼠NF-κB p65抗體和生物素化羊抗兔IgG(Santa Cruz)；SABC免疫組化試劑盒和DAB染液(武漢博士德生物工程有限公司)；兔抗大鼠β-actin多克隆抗體、兔抗大鼠腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α ,TNF-α)多克隆抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗(Santa Cruz)；ECL 顯影試劑盒(Amershem Pharmacia)；大鼠白細(xì)胞介素 1β(interleukin 1β, IL-1β)ELISA試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)比色法檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所生產(chǎn))。

1.2儀器 RWD407小動(dòng)物呼吸機(jī)(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)， ECG-101G VET動(dòng)物心電圖機(jī)(深圳市邦健電子有限公司)，3K15臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(Sigma)，4XBC電腦型雙目倒置式金相顯微鏡(上海蔡康光學(xué)儀器有限公司)。

1.3動(dòng)物 選用普通級SD成年雄性健康大鼠48只(遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。體重250～300 g。購回后在動(dòng)物室飼養(yǎng)3 d，以適應(yīng)環(huán)境。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度為18～25 ℃，濕度為50%～60%，正常光照，實(shí)驗(yàn)期間正常飲食，自由攝取自來水。

2方法

2.1實(shí)驗(yàn)分組及心肌缺血再灌注模型制作 將48只大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為6組,然后選取其中4組腹腔注射給藥：分別為淫羊藿苷高劑量組(80 mg · kg-1) 、中劑量組(40 mg·kg-1)和低劑量組(20 mg·kg-1)[4]，以及阿司匹林組(20 mg·kg-1)，另2組用生理鹽水腹腔注射，每天1次，每次每只2 mL。連續(xù)腹腔注射7 d，末次注射2 h后，藥物處理組和模型組結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支復(fù)制缺血再灌注模型，假手術(shù)組只穿線不結(jié)扎。上述SD大鼠按王桂敏等[5]的方法復(fù)制心肌缺血再灌注損傷模型。

2.2心肌組織結(jié)構(gòu)改變 實(shí)驗(yàn)完畢留取左室心尖部缺血中心區(qū)同一部位全層新鮮組織，用10% 甲醛固定后石蠟包埋、 HE 染色，光鏡下觀察缺血區(qū)心肌形態(tài)學(xué)和炎癥細(xì)胞浸潤情況。

2.3免疫組化法測定大鼠心肌組織NF-κB的表達(dá) 常規(guī)制作石蠟切片，脫蠟至水；利用甲醇+3% H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶；PBS液漂洗2 min×2次,移至0.05% Tween-20中，室溫5 min；以0.5% BSA濕盒內(nèi)室溫孵育20 min，吸去孵育液，不沖洗；5%正常山羊血清，濕盒內(nèi)室溫孵育20 min，吸去孵育液；滴加兔抗大鼠NF-κB p65抗體(1∶200),4 ℃孵育過夜,PBS洗2 min×3次；滴加生物素化羊抗兔IgG,37 ℃孵育50 min后PBS洗2 min×3次；滴加SABC，室溫下靜置20 min，PBS洗5 min×3次。DAB顯色，蘇木素復(fù)染,脫水、透明及封片,光鏡下觀察,胞漿棕黃色著色為陽性細(xì)胞,每只大鼠取4張切片，獲取切片圖像(×200)，隨機(jī)選取每張切片中的 4 個(gè)視野，各組免疫組化的陽性產(chǎn)物強(qiáng)度通過圖像分析系統(tǒng)測定灰度值 (灰度值范圍 0～225，0表示陽性產(chǎn)物表達(dá)最強(qiáng)，225表示陽性產(chǎn)物表達(dá)最弱)，用均數(shù)表示表達(dá)強(qiáng)度。

2.4Western blotting法檢測大鼠心肌組織TNF-α表達(dá) 液氮凍存的心肌組織100 mg，按沈誠等[6]的方法提取心肌細(xì)胞核蛋白，經(jīng) Bradford 法蛋白定量后，保存于-70 ℃?zhèn)溆谩Ｈ『说鞍讟悠芳拥润w積的 2×電泳樣品緩沖液加熱變性后，每泳道以 20 μg蛋白上樣，經(jīng) 10%十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)后，電轉(zhuǎn)至 PVDF 膜上。用 5%脫脂奶粉封閉后，先后加入兔抗大鼠 TNF-α 多克隆抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔 IgG。使用 ECL顯影試劑盒進(jìn)行顯影，定影。用 β-actin 作為內(nèi)參照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用光密度掃描儀掃描，目的條帶積分吸光度值與上樣內(nèi)參照積分吸光度值比較得出相對吸光度值。

2.5血清IL-1β 含量的測定 實(shí)驗(yàn)結(jié)束，右心室取血2 mL，室溫靜置1 h，3 000 r·min-1離心10 min，分離出血清，-80 ℃保存，通過ELISA法測定血清IL-1β含量。

2.6心肌髓過氧化物酶活性檢測 切取左室心尖部心肌100～150 mg，制成10%勻漿，利用供氫體鄰連茴香胺供氫生成黃色產(chǎn)物，通過比色法測定產(chǎn)物生成量，進(jìn)而推算出 MPO活性。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)來表示，采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。多組間比較用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1心肌組織結(jié)構(gòu)改變

光鏡下，假手術(shù)組心肌纖維排列整齊，橫紋排列整齊，無腫脹斷裂和變性壞死，無中性粒細(xì)胞浸潤；模型組可見心肌纖維腫脹，部分橫紋消失，局灶性出血、心肌細(xì)胞變性壞死，中性粒細(xì)胞大量浸潤。阿司匹林組心肌纖維輕度腫脹，排列尚有序，中性粒細(xì)胞少量浸潤。高劑量淫羊藿苷組部分心肌細(xì)胞水腫，極少有炎癥細(xì)胞浸潤，見圖1。

Figure 1. Optical micrographs of rat myocardial tissues(HE staining，×400).A:sham group;B:model group;C: low-dose icariin group;D: middle-dose icariin group;E:high-dose icariin group;F:aspirin group.

圖1大鼠心肌組織HE染色

2免疫組化法測定NF-κB的表達(dá)

與假手術(shù)組比較，模型組心肌細(xì)胞核內(nèi)見大量棕色顆粒，NF-κB p65 蛋白灰度值顯著減小(P<0.01)，表示模型組心肌細(xì)胞核內(nèi)NF-κB p65 蛋白表達(dá)顯著增加；與模型組比較，淫羊藿苷組和阿司匹林組心肌細(xì)胞核棕色顆粒減少，NF-κB p65 蛋白灰度值增大(P<0.05 或P<0.01)，表示 NF-κB p65 蛋白表達(dá)降低，淫羊藿苷高劑量組較中、低劑量組降低更明顯 (P<0.05)，呈劑量依賴關(guān)系；淫羊藿苷高劑量組與阿司匹林組比較差異不明顯(P>0.05)，見圖2、表 1。

Figure 2. Immunohistochemical staining of rat myocardial tissue NF-κB p65(×400). A: sham group;B:model group;C:low-dose icariin group;D: middle-dose icariin group;E: high-dose icariin group;F:aspirin group.

圖2大鼠心肌組織NF-κBp65免疫組化染色

表1大鼠心肌組織中NF-κBp65的灰度值

Table 1. NF-κB p65 gray values in rat myocardial tissues (Mean±SD.n=8)

GroupNF-κBp65(grayvalue)Sham198.53±12.19Model69.20±17.73**Low-doseicariin90.21±13.98△Middle-doseicariin120.33±15.23△△High-doseicariin162.96±14.29△△Aspirin163.00±13.98△△

**P<0.01vssham group;△P<0.05,△△P<0.01vsmodel group.

3用Westernblotting法檢測各組大鼠心肌組織TNF-α的表達(dá)水平

缺血再灌注后心肌組織中 TNF-α 水平變化如圖3所示。模型組TNF-α表達(dá)水平明顯高于假手術(shù)組(P<0.01);與模型組相比，淫羊藿苷各劑量組TNF-α均降低，且呈劑量依賴關(guān)系，淫羊藿苷中、高劑量組及阿司匹林組TNF-α水平顯著低于模型組(P<0.05)。淫羊藿苷高劑量組與阿司匹林組比較無顯著差異(P>0.05)。上述結(jié)果提示淫羊藿苷可以減少大鼠心肌細(xì)胞TNF-α的生成，減輕炎癥損傷。

Figure 3. Rat myocardial tissue TNF-α level.A:sham group;B:model group;C:low-dose icariin group;D: middle-dose icariin group;E: high-dose icariin group;F:aspirin group.Mean±SD.n=8.**P<0.01vssham group;△P<0.05vsmodel group.

圖3大鼠心肌組織TNF-α水平

4各組大鼠血清IL-1β水平

與假手術(shù)組比較，模型組血清IL-1β明顯增高(P<0.01)；與模型組比較，淫羊藿苷高中低劑量組血清IL-1β降低，且呈劑量依賴關(guān)系；淫羊藿苷高劑量組與阿司匹林組比較無顯著差異(P>0.05)，見表2。

5對大鼠心肌組織MPO活性的影響

與假手術(shù)組比較，各組缺血再灌注后心肌MPO活性明顯增高(P<0.01)。與模型組比較，淫羊藿苷高、中、低劑量組大鼠心肌組織MPO活性降低，且呈劑量依賴關(guān)系；淫羊藿苷高劑量組與阿司匹林組比較無顯著差異(P>0.05)，見表2。

表2大鼠血清IL-1β水平和大鼠心肌組織MPO活性

Table 2. IL-1β level in rat serum and MPO activity in rat myocardial tissues (Mean±SD.n=8)

GroupIL-1β(ng/L)MPO(U/g)Sham38.14±10.690.74±0.15Model95.82±18.31**1.38±0.31**Low-doseicariin84.38±17.96△1.30±0.24△Middle-doseicariin67.39±16.28△1.07±0.19△High-doseicariin59.67±14.32△0.95±0.12△Aspirin60.03±13.98△0.96±0.18△

**P<0.01vssham group;△P<0.05vsmodel group.

討 論

心肌缺血再灌注損傷是一個(gè)多機(jī)制參與、多因素相互影響而導(dǎo)致的復(fù)雜的病理生理過程。近年來，大量研究表明，炎癥反應(yīng)也參與了心肌缺血再灌注損傷的形成[7]。李擁軍等[8]研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞因子參與了心肌缺血再灌注損傷，炎癥細(xì)胞因子的增高是反映急性心肌梗死微循環(huán)再灌注不良的標(biāo)志。謝利平等[9]研究發(fā)現(xiàn)，抑制缺血再灌注后大鼠血清和組織中炎癥因子堆積，可以達(dá)到保護(hù)心肌的作用。

NF-κB 對免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)起調(diào)控作用，在心肌缺血再灌注損傷中起關(guān)鍵作用。炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β的增加和缺氧均可激活NF-κB，活化的NF-κB迅速進(jìn)入核內(nèi)啟動(dòng)炎癥細(xì)胞因子、選擇素和黏附分子的表達(dá)，升高的NF-κB等進(jìn)一步刺激NF-κB，形成正反饋，導(dǎo)致細(xì)胞因子水平不斷升高[10]?；罨?NF-κB和TNF-α可誘導(dǎo)大鼠心肌組織表達(dá)脂多糖誘導(dǎo)的趨化因子，引導(dǎo)中性粒細(xì)胞向再灌注組織趨化[11]。本研究結(jié)果表明，淫羊藿苷預(yù)先給藥可明顯抑制NF-κB的活化。

TNF-α也是一種重要的炎癥因子，通常在心肌組織中的水平較低，但發(fā)生心肌缺血再灌注損傷后，損傷的細(xì)胞便會(huì)釋放大量 TNF-α，并通過下游的途徑促進(jìn)心肌缺血再灌注損傷的進(jìn)展：TNF-α 可以抑制心肌的收縮功能；刺激中性粒細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞分泌黏附分子，加速細(xì)胞之間的黏附和血管內(nèi)凝血，引起心肌細(xì)胞壞死、凋亡等，加重心肌缺血再灌注損傷。殷然等[12]研究發(fā)現(xiàn)，抑制由心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧(anoxia/reoxygenation，A/R) 損傷造成的乳鼠心肌細(xì)胞炎癥因子 TNF-α表達(dá)，可以減輕乳鼠心肌細(xì)胞 A/R 損傷。

IL-1β 是一種重要的炎癥因子，在正常血清中的表達(dá)較低，當(dāng)心肌缺血再灌注損傷發(fā)生時(shí)其水平明顯升高。IL-1β 引起心肌組織損傷可能的機(jī)制：IL-1β 可以直接上調(diào)細(xì)胞間黏附分子 1等的表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞黏附于內(nèi)皮細(xì)胞及其基質(zhì)并通過內(nèi)皮進(jìn)入缺血區(qū)，通過釋放氧自由基、栓塞微血管等途徑，最終引起缺血再灌注后的心肌損傷及細(xì)胞凋亡[13-14]。

本研究結(jié)果顯示，淫羊藿苷低、中、高劑量組大鼠心肌組織 TNF-α 水平和血清IL-1β 濃度皆下降，且存在劑量依賴關(guān)系，其中淫羊藿苷高劑量組與阿司匹林組比較無顯著差異。模型組大鼠再灌注后心肌組織出現(xiàn)病變，心肌細(xì)胞排列稀疏，橫紋不清晰，心肌間質(zhì)水腫明顯，可見炎癥細(xì)胞浸潤。淫羊藿苷中、高劑量組大鼠心肌缺血再灌注時(shí)，心肌組織炎癥細(xì)胞浸潤減輕，與炎癥因子 TNF-α 及 IL-1β 釋放量減少的結(jié)果一致，證明了淫羊藿苷能夠顯著抑制心肌缺血再灌注損傷時(shí)的炎癥反應(yīng)。

MPO是中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞內(nèi)嗜天青顆粒產(chǎn)生的一種重要的過氧化物酶，檢測組織、血清中的MPO活性可以反映中性粒細(xì)胞浸潤程度[15-16]。其含量增高可以間接反映組織中存在炎癥,所以,只要有中性粒細(xì)胞浸潤的組織都能夠通過MPO活性的測定來判定細(xì)胞浸潤程度。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組心肌中MPO活性明顯增強(qiáng)，這說明白細(xì)胞大量浸潤;中、高劑量淫羊藿苷預(yù)處理可顯著降低心肌組織中MPO活性，減少白細(xì)胞的浸潤。HE染色結(jié)果與之相符。

綜上所述，本研究結(jié)果表明淫羊藿苷可以降低大鼠血清中炎癥因子 IL-1β 及心肌組織TNF-α的生成和釋放，降低心肌組織 MPO 活性和NF-κB表達(dá)，改善心肌組織的病理變化。這說明淫羊藿苷可能通過抑制心肌缺血再灌注損傷的炎癥反應(yīng)來發(fā)揮心肌保護(hù)作用，并且炎癥因子及炎癥細(xì)胞水平與淫羊藿苷劑量存在依賴關(guān)系，但具體的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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Effectsoficariinpreconditioningoninflammatoryresponsesinmyocar-dialischemia-reperfusioninjury

GUO Qing-jun1, WANG Gui-min2, ZHANG Xiu-xiu1

(1GraduateCollege,2TheFirstAffiliatedHospital,LiaoningMedicalUniversity,Jinzhou121000,China.E-mail:wangguimin4197176@163.com)

AIM: To observe the effects of icariin on myocardial ischemia-reperfusion injury.METHODSThe left anterior descending coronary artery was ligated for 30 min and then loosened for 2 h to establish the rat model of myocardial ischemia-reperfusion injury. Forty-eight healthy adult male SD rats weighing 250～300 g were randomly divided into sham group, model group, low-， middle-and high-dose icariin groups, and aspirin group. The morphological changes of the myocardium were observed by HE staining. The protein expression of NF-κB p65 in the myocardial nucleus was determined by the method of immunohistochemistry. The content of tumor necrosis factor α (TNF-α) in the myocardial tissues was detected by Western blotting. The level of interleukin 1β (IL-1β) in the serum was measured by ELISA. The activity of myeloperoxidase (MPO) in the myocardial tissues was assayed by colorimetry.RESULTSCompared with sham group, TNF-α content, IL-1β concentration, NF-κB expression and MPO activity in all other groups increased. Compared with model group, TNF-α content, IL-1β concentration, NF-κB expression and MPO activity in low-, middle- and high-dose icariin groups and aspirin group all decreased. No significant difference of the above parameters between high-dose icariin group and aspirin group was observed.CONCLUSIONIcariin preconditioning reduces inflammatory responses in the process of myocardial ischemia-reperfusion injury in a dose-dependent manner.

Icariin; Myocardial ischemia; Reperfusion injury; Inflammation

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.11.021

1000- 4718(2013)11- 2034- 05

2013- 07- 26

2013- 10- 08

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