王 煥, 李小毛, 劉穗玲, 李 田, 丁 杰

(中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東 廣州 510630)

RAD001通過誘導(dǎo)自噬提高人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏感性*

王 煥, 李小毛△, 劉穗玲, 李 田, 丁 杰

(中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東 廣州 510630)

目的探討哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)抑制劑RAD001通過誘導(dǎo)細(xì)胞自噬增強(qiáng)紫杉醇?xì)訉m內(nèi)膜癌細(xì)胞作用的機(jī)制。方法用MTT法檢測(cè)RAD001對(duì)人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa和HEC-1A細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，用激光共聚焦顯微鏡觀察GFP-LC3蛋白的聚集；用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞死亡；用Western blotting方法檢測(cè)LC3-I、LC3-II、mTOR及ULK1蛋白的表達(dá)；用靶向ULK1的siRNA特異性地抑制Ishikawa細(xì)胞中ULK1的表達(dá)，再檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。結(jié)果RAD001可抑制Ishikawa和HEC-1A細(xì)胞的增殖，提高它們對(duì)紫杉醇的敏感性。RAD001誘導(dǎo)Ishikawa和HEC-1A細(xì)胞發(fā)生自噬及自噬性細(xì)胞死亡。RAD001通過抑制mTOR/p70S6K通路、上調(diào)ULK1誘導(dǎo)自噬，從而產(chǎn)生紫杉醇增敏作用。結(jié)論RAD001可以通過抑制mTOR信號(hào)通路，上調(diào)ULK1的表達(dá)，誘導(dǎo)自噬性細(xì)胞死亡的發(fā)生，從而提高子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏感性。

RAD001； Ishikawa細(xì)胞； HEC-1A細(xì)胞； 自噬； 紫杉醇

近年來，子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率不斷上升，在西方國(guó)家已經(jīng)占據(jù)女性生殖系統(tǒng)腫瘤發(fā)病率第1位[1]。 盡管早期的子宮內(nèi)膜癌能夠被放療或手術(shù)等方法治愈，但進(jìn)展期及轉(zhuǎn)移性子宮內(nèi)膜癌的治療仍存在較大困難。因此，尋找新的有效的治療方案成為子宮內(nèi)膜癌的研究熱點(diǎn)。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)是PI3K/Akt 通路的下游分子,以mTOR 為靶點(diǎn)可抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞毒藥物的耐藥性。細(xì)胞自噬(autophagy)是細(xì)胞在能量缺乏、饑餓等代謝壓力下的一種生理過程[2]，自噬與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。自噬一方面可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生存，另一方面，細(xì)胞自噬能抑制腫瘤發(fā)生[3]。自噬對(duì)腫瘤的作用依賴于腫瘤類型和不同的刺激處理，具體的機(jī)制尚未完全清楚。目前，mTOR與自噬關(guān)系的研究已取得較大進(jìn)展。研究表明，通過抑制mTOR表達(dá)調(diào)控自噬對(duì)腫瘤治療可能有重要的意義[4-6]。

RAD001(everolimus)即40-O-(2-羥乙基)-雷帕霉素， 是一種新型的口服mTOR抑制劑。臨床前研究表明，對(duì)于一些耐藥細(xì)胞株，RAD001 與細(xì)胞毒藥物或其它靶點(diǎn)藥物聯(lián)用有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和促使其死亡的作用[7]。在PTEN基因缺失的前列腺癌細(xì)胞中，RAD001 可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬和增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)放療的敏感性[8]。RAD001 與細(xì)胞毒藥物聯(lián)用的一系列臨床試驗(yàn)初步結(jié)果均提示RAD001 與化療藥聯(lián)用有相加或協(xié)同作用，且毒副反應(yīng)并未明顯增加[9-10]。因此，本研究對(duì)RAD001促進(jìn)人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞自噬及Akt/mTOR通路在其中的作用機(jī)制進(jìn)行了探討，旨在探索通過抑制 mTOR誘發(fā)自噬從而增敏化療、逆轉(zhuǎn)紫杉醇耐藥的可行性，希望為化療耐藥的患者尋找新的希望。

材 料 和 方 法

1材料

人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株Ishikawa及HEC-1A購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所。細(xì)胞在含10% FBS、5×104U/L青霉素、50 mg/L鏈霉素和2 mmol/L谷氨酰胺的DMEM培養(yǎng)液中37 ℃、5% CO2培養(yǎng)。所有實(shí)驗(yàn)均在細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)進(jìn)行。

RAD001 (07741)、氯喹(chloroquine，CQ)及MTT購(gòu)于Sigma-Aldrich；RAD001 用DMSO 配制成1 mmol/L貯備液。mTOR、p-mTOR、p70S6K和p-p70S6K抗體購(gòu)自Cell Singnaling；LC3和ULK1抗體購(gòu)自Novus Biological；辣根過氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗購(gòu)自Santa Cruz； GAPDH 購(gòu)自上?？党杉夹g(shù)有限公司。

2方法

2.1MTT法 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞加入96孔板中，每孔7 000～8 000個(gè)細(xì)胞(195 μL/well)。加入藥物，每組設(shè)4個(gè)平行孔，置37 ℃培養(yǎng)72 h，實(shí)驗(yàn)中止前4 h加入10 μL MTT液(5 g/L)，再培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)液，加入0.1 mL DMSO，待結(jié)晶溶解后在酶聯(lián)檢測(cè)儀上檢測(cè)570 nm波長(zhǎng)下每孔的A值。按下列公式求出生長(zhǎng)抑制率：生長(zhǎng)抑制率(%)=(1-用藥組平均A值/對(duì)照組平均A值)×100%。用BLISS軟件計(jì)算出半數(shù)抑制率IC50。

2.2激光共聚焦顯微鏡觀察GFP-LC3 以1.5×108/L的密度,應(yīng)用無抗體的10%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液接種細(xì)胞于6孔板中培養(yǎng)，貼壁后以脂質(zhì)體LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染GFP-LC3質(zhì)粒，G418篩選穩(wěn)定表達(dá)GFP-LC3的細(xì)胞，加藥處理24 h后，倒去培養(yǎng)液，用PBS洗滌3次，激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察、拍照。GFP-LC3質(zhì)粒購(gòu)自北京西美杰科技有限公司。

2.3Western blotting檢測(cè) 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，稀釋成2×108/L，接種于6孔板，每孔2 mL，藥物處理細(xì)胞后，收集細(xì)胞，PBS洗滌3次，加入細(xì)胞裂解液100 μL，14 000 r/min離心10 min，定量蛋白，取40 μg蛋白，加入上樣緩沖液，95 ℃下變性10 min。聚丙烯酰胺SDS凝膠電泳后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉后依次加入Ⅰ抗、Ⅱ抗，在室溫下孵育2 h，TBST緩沖液(10 mmol/L Tris-HCl, pH 7.4，150 mmol/L NaCl，0.1% Tween-20)洗滌3次，每次10 min，加入化學(xué)發(fā)光劑，放入暗盒中并壓片，2～5 min后顯影、定影。

2.4流式細(xì)胞術(shù) (flow cytometry，F(xiàn)CM) 檢測(cè)細(xì)胞死亡 收集用藥物處理過的細(xì)胞，PBS洗滌2次，離心。加入PBS調(diào)整細(xì)胞密度為1×109/L。取1 mL細(xì)胞懸液，加入10 μL 碘化丙啶(propidium iodide,PI; 10 mg/L)染色10 min，避光。立即將標(biāo)本置于冰塊中，1 h 內(nèi)用流式細(xì)胞儀(Becton Dickinson)檢測(cè)。

2.5siRNA干擾實(shí)驗(yàn) 設(shè)計(jì)靶向ULK1的siRNA序列為5’-GCCCTTTGCGTTATATTGTAT-3’和5’-CCTGGTTATGGAGTACTGCAA-3’。轉(zhuǎn)染前24 h消化和計(jì)數(shù)腫瘤細(xì)胞，在6孔板中接種細(xì)胞，待細(xì)胞達(dá)到50%～60% 融合時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將5 μL siRNA稀釋于100 μL無血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基opti-MEM中，室溫放置5 min；取2 μL LipofectamineTM2000 稀釋于100 μL無血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基opti-MEM中，室溫放置5 min；將稀釋的siRNA溶液加入脂質(zhì)體溶液中，輕柔混勻，室溫放置20 min；吸棄細(xì)胞培養(yǎng)物中的完全培養(yǎng)基，用基礎(chǔ)培養(yǎng)基opti-MEM漂洗細(xì)胞2次，加入無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基opti-MEM 0.8 mL；將siRNA-脂質(zhì)體復(fù)合物加入細(xì)胞中，前后輕晃6孔板使混合液分散均勻。4～6 h 后吸棄轉(zhuǎn)染復(fù)合物，換入含10%胎牛血清的新鮮培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染后24 h 進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 16.0 軟件分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)或t檢驗(yàn)，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1RAD001可抑制人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞及HEC-1A細(xì)胞的增殖

以2.5、5、10、20、40和80 nmol/L RAD001處理Ishikawa細(xì)胞和HEC-1A細(xì)胞72 h，出現(xiàn)明顯的增殖抑制作用，且呈濃度依賴性，其IC50分別為(36.80±1.64) nmol/L和(25.72±1.16) nmol/L，見圖1。上述結(jié)果說明RAD001能抑制Ishikawa細(xì)胞和HEC-1A細(xì)胞的增殖。

Figure 1. RAD001 suppressed the proliferation of Ishikawa cells (A) and HEC-1A cells (B). The cells were cultured in a 96-well plate (6 000 cells/well), exposed to the indicated concentrations of RAD001 and incubated for 72 h.mean±SD.n=3.

圖1RAD001抑制Ishikawa細(xì)胞和HEC-1A細(xì)胞的增殖

2RAD001提高人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞及HEC-1A細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏感性

RAD001聯(lián)合不同濃度的紫杉醇作用于人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞及HEC-1A細(xì)胞后，細(xì)胞生長(zhǎng)受到明顯抑制，其抑制率隨藥物濃度增加逐漸升高，見圖2。在Ishikawa細(xì)胞中，單藥紫杉醇的 IC50為(3.91±0.17)μmol/L，兩藥聯(lián)用指數(shù)為 0.326。在HEC-1A細(xì)胞中，單藥紫杉醇的IC50為(6.72±1.14) μmol/L，兩藥聯(lián)用指數(shù)為0.805。兩種細(xì)胞株中藥物聯(lián)用指數(shù)均小于1，說明兩藥聯(lián)合應(yīng)用對(duì)人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞及HEC-1A細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制具有協(xié)同作用。

Figure 2. Cell inhibitory rate of taxol and RAD001 alone or together at the indicated concentrations for 72 h. Cells were cultured in a 96-well plate (6 000 cells/well), exposed to the indicated concentrations of taxol and RAD001 (30 nmol/L) for 72 h. The growth inhibition was detected using MTT assay, and the combination index (CI) was determined using CalcuSyn software.Mean±SD.n=3.*P<0.05vstaxol.

圖2RAD001和紫杉醇聯(lián)用對(duì)Ishikawa細(xì)胞及HEC-1A細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制具有協(xié)同作用

3RAD001誘導(dǎo)人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa及HEC-1A細(xì)胞發(fā)生自噬

LC3作為自噬體膜標(biāo)志性蛋白，定位在自噬體內(nèi)外膜上。由圖 3A 中可以看出，RAD001 處理可使瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 GFP-LC3 質(zhì)粒的 Ishikawa 及 HEC-1A 細(xì)胞胞漿中出現(xiàn)大量綠色熒光點(diǎn)狀聚集，提示自噬體的形成。Western blotting檢測(cè)的結(jié)果顯示，不同濃度的 RAD001 處理上述細(xì)胞 24 h 后，LC3-I 逐漸向LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)化，并呈現(xiàn)明顯的濃度依賴效應(yīng)，見圖3B。這些結(jié)果說明 RAD001 可以誘導(dǎo) Ishikawa 細(xì)胞及 HEC-1A 細(xì)胞發(fā)生自噬。

Figure 3. RAD001 induced autophagy in Ishikawa cells and HEC-1A cells. A: the cells treated with RAD001 (30 nmol/L) for 24 h, the dots of GFP-LC3 accumulation were observed under confocal microscope; B: the cells were treated with RAD001 at the indicated concentrations for 24 h, and Western blotting was used for detecting LC3-I and LC3-II.

圖3RAD001誘導(dǎo)Ishikawa細(xì)胞及HEC-1A細(xì)胞發(fā)生自噬

4RAD001誘導(dǎo)Ishikawa細(xì)胞和HEC-1A細(xì)胞發(fā)生自噬性細(xì)胞死亡

由圖4A中可以看出，當(dāng)聯(lián)用CQ處理細(xì)胞后，LC3-II及p62的聚集較分別RAD001單用時(shí)明顯增多，表明CQ能夠有效地阻斷自噬，引起自噬溶酶體內(nèi)蛋白質(zhì)的不斷堆積。MTT的結(jié)果顯示，自噬的抑制使RAD001對(duì)Ishikawa細(xì)胞和HEC-1A細(xì)胞的抑制明顯下調(diào)，見圖4B。這提示RAD001誘導(dǎo)人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞和HEC-1A細(xì)胞發(fā)生自噬性細(xì)胞死亡。

Figure 4. Treatment with RAD001 induced autophagic cell death in Ishkawa cells and HEC-1A cells. A: lysates from Ishikawa cells or HEC-1A cells were treated with RAD001 (30 nmol/L) and CQ (10 mg/mL) alone or together, and Western blotting was used to detect the expression of LC3-II and p62; B: the cells were incubated with the indicated concentrations of RAD001 or in combination with 10 mg/mL CQ for 24 h,and the inhibitory rate was detected by MTT assay.Mean±SD.n=3.*P<0.05vsRAD001.

圖4RAD001誘導(dǎo)Ishikawa細(xì)胞和HEC-1A細(xì)胞發(fā)生自噬性細(xì)胞死亡

5RAD001抑制mTOR/p70S6K通路

RAD001能顯著抑制Ishikawa細(xì)胞及HEC-1A細(xì)胞中mTOR的磷酸化水平，并隨藥物濃度的增加抑制作用越明顯，且mTOR的總量并無改變，見圖5。進(jìn)一步觀察到mTOR下游重要底物p70S6K的磷酸化水平被明顯抑制，而其總量并無改變，見圖5。這些結(jié)果提示RAD001作用于腫瘤細(xì)胞Ishikawa及HEC-1A后，可以顯著抑制其mTOR途徑。

6RAD001上調(diào)自噬相關(guān)蛋白ULK1的表達(dá)

ULK1是參與自噬的重要蛋白，在自噬體形成早期發(fā)揮重要的作用。Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，RAD001能顯著上調(diào)Ishikawa細(xì)胞及HEC-1A細(xì)胞中ULK1蛋白的表達(dá)水平，并呈顯著的濃度依賴性，見圖6。

7RAD001通過上調(diào)ULK1誘導(dǎo)自噬而產(chǎn)生紫杉醇增敏效應(yīng)

圖7A顯示，siRNA干擾使ULK1的表達(dá)下降70%以上。由圖7B中可以看出，ULK1的表達(dá)下調(diào)后，RAD001誘導(dǎo)的LC3-I向LC3-II的轉(zhuǎn)化被顯著地抑制。RAD001分別處理Ishikawa/control和Ishikawa/siULK1細(xì)胞，PI染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抑制ULK1表達(dá)有效阻斷了RAD001誘導(dǎo)的自噬性細(xì)胞死亡，見圖7C。RAD001聯(lián)合紫杉醇處理可以明顯增加細(xì)胞死亡，ULK1表達(dá)抑制有效阻斷了這一增敏作用，見圖7D。上述結(jié)果提示RAD001通過上調(diào)ULK1誘導(dǎo)自噬，增強(qiáng)紫杉醇的抗腫瘤效應(yīng)。

Figure 5. The effect of RAD001 on mTOR pathway in Ishikawa cells and HEC-1A cells. The cells were treated with RAD001 at the indicated concentrations for 24 h. The cell lysates were analyzed by Western blotting.

圖5RAD001顯著抑制Ishikawa細(xì)胞及HEC-1A細(xì)胞的mTOR通路

Figure 6. The effect of RAD001 on ULK1 expression in Ishikawa cells and HEC-1A cells. The cells were treated with the indicated concentrations of RAD001 for 24 h, and the expression of ULK1 was examined by Western blotting.

圖6RAD001顯著上調(diào)Ishikawa細(xì)胞及HEC-1A細(xì)胞中ULK1蛋白的表達(dá)水平

Figure 7. Silencing ofULK1 blocked RAD001-mediated autophagy and cell death. A: Ishikawa cells were transfected withULK1 siRNA-1 and -2, and the ULK1 protein expression was determined by Western blotting; B: Ishikawa cells were treated with RAD001 (30 nmol/L) in the absence or presence ofULK1 siRNA, and then LC3 protein expression was analyzed; C and D: Ishikawa/control cells and Ishikawa/siULK1 cells were exposed to RAD001 (30 nmol/L) or taxol (4 μmol/L) for 24 h, and the number of dead cells was quantified using PI staining and flow cytometry.Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol;△P<0.05vstaxol;#P<0.05vstaxol+RAD001.

圖7RAD001通過上調(diào)ULK1誘導(dǎo)自噬而產(chǎn)生紫杉醇增敏作用

討 論

子宮內(nèi)膜癌目前是婦科三大惡性腫瘤之一，發(fā)病率逐年上升，已占到女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的20%～30%。部分國(guó)家已經(jīng)超過宮頸癌，成為最常見的女性生殖道惡性腫瘤[1]。

mTOR是PI3K/Akt 通路的下游分子，以mTOR 為靶點(diǎn)可抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞毒藥物的耐藥性。目前，以mTOR為治療靶點(diǎn)已成為腫瘤治療的研究新熱點(diǎn)，mTOR抑制劑RAD001正是其中的代表之一，它作為一種有潛力的腫瘤治療劑已經(jīng)引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。

紫杉醇是當(dāng)前子宮內(nèi)膜癌聯(lián)合化療中最常用的藥物之一，但其藥理作用的發(fā)揮往往需要很高劑量，從而導(dǎo)致患者較為嚴(yán)重的不良反應(yīng)。在本研究中，作者利用RAD001 聯(lián)合紫杉醇處理人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa及HEC-1A細(xì)胞，結(jié)果顯示RAD001可提高人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa及HEC-1A細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏感性，從而提示RAD001 與紫杉醇聯(lián)合應(yīng)用不但可以增強(qiáng)紫杉醇的藥理作用，而且可以減少其劑量，從而達(dá)到增效減毒的作用。另外RAD001 具有只針對(duì)腫瘤細(xì)胞、不攻擊正常細(xì)胞、對(duì)正常機(jī)體不良反應(yīng)小的優(yōu)點(diǎn)[11]。因此，RAD001 可以作為一種較理想的協(xié)同化療藥物，具有廣泛的臨床應(yīng)用前景。

自噬是一個(gè)保守的代謝過程，在饑餓、缺氧、高熱及藥物誘導(dǎo)的情況下發(fā)生，能夠降解長(zhǎng)周期蛋白、細(xì)胞器和胞質(zhì)。mTOR作為一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，在細(xì)胞自噬信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中處于核心地位。作為mTOR的抑制劑，我們的研究證實(shí)RAD001可以誘導(dǎo)Ishikawa及HEC-1A細(xì)胞發(fā)生自噬。自噬是維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的重要途徑，然而，自噬也被稱為II型程序性細(xì)胞死亡。因此，我們?cè)谘芯靠鼓[瘤藥物誘導(dǎo)的自噬時(shí)，更需謹(jǐn)慎判斷自噬的作用。本研究中，我們進(jìn)一步應(yīng)用自噬抑制劑CQ阻斷自噬的發(fā)生，結(jié)果表明自噬被有效地抑制后，死亡的細(xì)胞減少，細(xì)胞存活率增高。上述結(jié)果證明RAD001誘導(dǎo)的是自噬性細(xì)胞死亡。

已有研究證實(shí)，在饑餓或雷帕霉素作用條件下，mTOR活性被抑制，Atg13去磷酸化，與Atg1親和力增加，并與Atg17-29-31緊密結(jié)合，形成Atg1復(fù)合體，在Atg13和Atg17共同作用下，Atg1激活，定位于前自噬體結(jié)構(gòu)(pre-autophagosomal structure,PAS)，從而啟動(dòng)自噬的發(fā)生[12-13]。因此mTOR是自噬的負(fù)調(diào)控分子，并發(fā)揮自噬啟動(dòng)“門衛(wèi)”的作用。在本研究中，我們證實(shí)RAD001能顯著抑制Ishikawa細(xì)胞及HEC-1A細(xì)胞中mTOR的磷酸化水平，進(jìn)而抑制其下游重要底物p70S6K的激活。我們的研究進(jìn)一步證實(shí)RAD001能上調(diào)ULK1的表達(dá)，抑制ULK1表達(dá)有效阻斷了RAD001誘導(dǎo)的自噬性細(xì)胞死亡。

綜上所述，在人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞及HEC-1A細(xì)胞中，RAD001可以通過抑制mTOR信號(hào)通路，上調(diào)ULK1的表達(dá)，誘導(dǎo)自噬性細(xì)胞死亡的發(fā)生，從而提高腫瘤細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏感性。本實(shí)驗(yàn)表明RAD001在子宮內(nèi)膜癌的治療方面有望成為一種新型的化療增敏劑，進(jìn)一步豐富了子宮內(nèi)膜癌的治療模式。

[1] Jemal A, Siegel R, Xu J, et al. Cancer statistics, 2010[J]. CA Cancer J Clin, 2010, 60(5):277-300.

[2] Boya P, Gonzalez-Polo RA, Casares N, et al. Inhibition of macroautophagy triggers apoptosis[J]. Mol Cell Biol, 2005, 25(3):1025-1040.

[3] 胡鵬飛，賴東武，何 紅. 自噬在晚期糖基化終產(chǎn)物誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中的作用[J]. 中國(guó)病理生理雜志，2012, 28(6):1006-1011.

[4] Ganley IG, Lam DH, Wang J, et al. ULK1·ATG13·FIP200 complex mediates mTOR signaling and is essential for autophagy[J]. J Biol Chem, 2009, 284(18): 12297-12305.

[5] Guertin DA, Sabatini DM. Defining the role of mTOR in cancer[J]. Cancer Cell,2007, 12(1): 9-22.

[6] Hippert MM, O’Toole PS, Thorburn A. Autophagy in cancer: good, bad or both? [J]. Cancer Res, 2006, 66(19): 9349-9351.

[7] Dengler J, von Bulonoff N, Decker T, et al. Combination of imatinib with rapamycin or RAD001 acts synergistically only in Bcr-Abl-positive cells with moderate resistance to imatinib[J]. Leukemia, 2005, 19(10):1835-1838.

[8] Cao C, Subhawong T, Albert JM, et al. Inhibition of mammalian target of rapamycin or apoptotic pathway induces autophagy and radiosensitizes PTEN null prostate cancer cells[J]. Cancer Res, 2006, 66(20):10040-10047.

[9] Haritunians T, Mori A, O’Kelly J, et al. Antiproliferative activity of RAD001 (everolimus) as a single agent and combined with other agents in mantle cell lymphoma[J]. Leukemia, 2007, 21(2):333-339.

[10] Panner A, Parsa AT, Pieper RO. Use of APO2L/TRAIL with mTOR inhibitors in the treatment of glioblastoma multiforme [J]. Expert Rev Anticancer Ther, 2006, 6(9):1313-1322.

[11] 陳 樑，張紅峰．mTOR 信號(hào)通路與癌癥治療[J]．生命的化學(xué)， 2005，25(2)：127-129.

[12] Park HJ, Lee SJ, Kim SH, et al. IL-10 inhibits the starvation induced autophagy in macrophages via class I phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) pathway[J]. Mol Immunol, 2011, 48(4):720-727.

[13] Alonso S, Pethe K, Russell DG, et al. Lysosomal killing of mycobacterium mediated by ubiquitin-derived peptides is enhanced by autophagy[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2007, 104(14): 6031-6036.

RAD001promoteschemotherapeuticsensitivityofhumanendometrialcarcinomacellstopaclitaxelviainducingautophagy

WANG Huan, LI Xiao-mao, LIU Sui-ling, LI Tian, DING Jie

(DepartmentofObstetricsandGynecology,theThirdAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510630,China.E-mail:tigerlee777@163.com)

AIM: To explore the effect of mammalian target of rapamycin (mTOR) inhibitor RAD001 on chemotherapeutic sensitivity of endometrial carcinoma cells to paclitaxel.METHODSMTT assay and PI staining were used to assess the cell death. The protein expression of LC3-I, LC3-II, mTOR and ULK1 was detected by Western blotting.ULK1 siRNA was used to abolish the activation of ULK1.RESULTSRAD001 significantly inhibited the growth of human endometrial carcinoma cell lines Ishikawa and HEC-1A. RAD001 enhanced the inhibitory effect of paclitaxel on the growth of Ishikawa cells and HEC-1A cells. RAD001 induced autophagy and autophagic cell death by the inhibition of mTOR/p70S6K pathway and up-regulation of ULK1 expression.CONCLUSIONRAD001 enhances the inhibitory effect of paclitaxel on endometrial carcinoma cell growth by inducing autophagy and autophagic cell death.

RAD001; Ishikawa cells; HEC-1A cells; Autophagy; Paclitaxel

R737.31

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.11.009

1000- 4718(2013)11- 1966- 06

2013- 08- 20

2013- 11- 04

廣州市科技計(jì)劃資助項(xiàng)目(No. 2012KP072)

△通訊作者 Tel: 020-85253040； E-mail: tigerlee777@163.com