費(fèi)洪榮， 趙 瑩， 王桂玲， 曲曉蘭， 王鳳澤

(泰山醫(yī)學(xué)院 1藥學(xué)院， 2生物科學(xué)學(xué)院， 3醫(yī)藥生物技術(shù)研究所，山東 泰安 271016)

PI3K/mTOR雙重抑制劑PF-04691502誘導(dǎo)人胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡*

費(fèi)洪榮1， 趙 瑩1， 王桂玲1， 曲曉蘭1， 王鳳澤2,3△

(泰山醫(yī)學(xué)院1藥學(xué)院，2生物科學(xué)學(xué)院，3醫(yī)藥生物技術(shù)研究所，山東 泰安 271016)

目的檢測PI3K/mTOR雙重抑制劑PF-04691502對人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖和凋亡的影響及可能的分子機(jī)制。方法MTT法檢測細(xì)胞活力；流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期變化；Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)法測定細(xì)胞凋亡；免疫印跡分析細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果PF-04691502處理SGC-7901細(xì)胞后，降低細(xì)胞的活力并促進(jìn)細(xì)胞阻滯于G1期，同時(shí)抑制cyclin D1的表達(dá)并上調(diào)p21的蛋白水平。PF-04691502可明顯誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞凋亡，其機(jī)制與其促進(jìn)caspase家族成員的活化并切割聚(腺苷二磷酸核糖)聚合酶[poly(ADP-ribose)polymerase, PARP] 底物密切相關(guān)。結(jié)論P(yáng)I3K/mTOR 雙重抑制劑PF-04691502能夠通過阻滯細(xì)胞周期來抑制SGC-7901細(xì)胞的增殖，同時(shí)能夠激活細(xì)胞內(nèi)caspase，使PARP發(fā)生剪切而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

PF-04691502； PI3K/mTOR； 細(xì)胞增殖； 細(xì)胞凋亡； 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶類

磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B/mammalian target of rapamycin, PI3K/Akt/mTOR)信號途徑作為真核細(xì)胞內(nèi)重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[1-2]。 PI3K是一個(gè)脂激酶家族，參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、凋亡和分化等生命過程；mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其羧基末端與PI3K催化區(qū)高度同源，是PI3K信號通路的一個(gè)關(guān)鍵調(diào)節(jié)位點(diǎn)[3]。研究發(fā)現(xiàn)，多種實(shí)體瘤的發(fā)生與PI3K/Akt/mTOR信號通路的突變或過度活化密切相關(guān)，因此抑制該信號途徑已成為臨床上腫瘤治療的有效手段，篩選PI3K/Akt/mTOR抑制劑并研究其抑癌活性則具有重要的理論意義與治療價(jià)值[4-5]。本研究以人胃癌SGC-7901細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)材料，檢測PI3K和mTOR的雙重靶向抑制劑PF-04691502對SGC-7901細(xì)胞增殖和凋亡的影響，從而為胃癌臨床用藥提供理論指導(dǎo)與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1細(xì)胞培養(yǎng)

人胃癌細(xì)胞株SGC-7901購自南京凱基生物有限公司，于37 ℃和5% CO2條件下用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。

2試劑

PF-04691502 購自 Selleck Chemicals；RPMI-1640 培養(yǎng)基和胎牛血清購自 Gibco；MTT購自Genview；propidium iodide (PI)購自Sigma-Aldrich；Annexin V-FITC 購自南京凱基生物有限公司；caspase-3抗體、caspase-8抗體、caspase-9抗體和多聚(ADP-核糖)聚合酶[poly(ADP-ribose)polymerase,PARP]抗體購自Cell Signaling Technology；β-actin抗體購自Sigma；cyclin D1抗體和p21抗體購自Santa Cruz；Ⅱ抗均購自北京中杉金橋生物公司。

3MTT檢測細(xì)胞活力

SGC-7901細(xì)胞接種于96孔板中，用不同劑量的PF-04691502 處理后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，對照組加入DMSO；終止培養(yǎng)前4 h加20 μL(5 g/L)的MTT。吸去培養(yǎng)基后加入150 μL DMSO，室溫振蕩5～10 min；490 nm波長下測定各孔的吸光度，以同樣的方法測6個(gè)平行孔的吸光度讀數(shù)并計(jì)算平均值。

4流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期與凋亡

PF-04691502處理SGC-7901細(xì)胞24 h后，胰酶消化并制備單細(xì)胞懸液；用75%冷無水乙醇4 ℃固定過夜后加入50 mg/L RNase A，37 ℃ 孵育30 min，加50 mg/L PI閉光染色 15 min，接著上機(jī)檢測并分析細(xì)胞的周期分布。細(xì)胞凋亡檢測操作參照試劑盒說明書進(jìn)行，根據(jù)Annexin V和PI的熒光強(qiáng)度計(jì)算凋亡百分率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

5免疫印跡實(shí)驗(yàn)

RIPA細(xì)胞裂解液冰上裂解細(xì)胞20 min，4 ℃ 13 000×g離心20 min后收集上清并定量分析。取30 μg總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分離蛋白，然后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉后加入Ⅰ抗；室溫孵育3 h后加入Ⅱ抗孵育1 h后暗室曝光顯影。

6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD) 表示，均數(shù)比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1PF-04691502抑制SGC-7901細(xì)胞的增殖

SGC-7901細(xì)胞經(jīng)不同劑量的PF-04691502處理24 h后，MTT法檢測細(xì)胞活力，結(jié)果見圖1，PF-04691502抑制了SGC-7901細(xì)胞的活力。

Figure 1. PF-04691502 reduced the viability of SGC-7901 cells. Cells were incubated with PF-04691502 at the indicated concentrations for 24 h and then processed for MTT assay. Mean±SD.n=6.

圖1MTT法檢測PF-04691502對SCC-7901細(xì)胞活力的抑制作用

2PF-04691502阻滯SGC-7901細(xì)胞于G1期

采用流式細(xì)胞術(shù)檢測了PF-04691502對SGC-7901細(xì)胞周期的影響，發(fā)現(xiàn)PF-04691502作用于SGC-7901細(xì)胞后，細(xì)胞明顯阻滯于G1期，而處于S期的細(xì)胞數(shù)目則明顯減少，見圖2。

Figure 2. PF-04691502 treatment resulted in cell cycle arrest at G1stage. SGC-7901 cells were exposed to different concentrations of PF-04691502 for 24 h. The cell cycle analysis was determined by PI staining and flow cytometry. Mean±SD.n=3.

圖2PF-04691502作用SGC-7901細(xì)胞24h后，流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期的變化

免疫印跡結(jié)果表明，PF-04691502誘導(dǎo)細(xì)胞G1期阻滯與其抑制cyclin D1的蛋白水平，并上調(diào)p21的表達(dá)密切相關(guān)，見圖3。

Figure 3. PF-04691502 down-regulated cyclin D1 expression and up-regulated p21 expression in SGC-7901 cells. Cells were cultured for 24 h in the presence of increasing doses of PF-04691502. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μ mol/L.

圖3PF-04691502對SGC-7901細(xì)胞中cyclinD1及p21表達(dá)的影響

3PF-04691502對SGC-7901細(xì)胞凋亡的影響

SGC-7901細(xì)胞經(jīng)PF-04691502處理后，細(xì)胞發(fā)生明顯的凋亡，見圖4。

免疫印跡結(jié)果顯示，SGC-7901細(xì)胞經(jīng)PF-04691502作用24 h后，caspase-3、caspase-8、caspase-9和PARP出現(xiàn)明顯的活性切割，見圖5。

討 論

近年的研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt信號途徑參與腫瘤細(xì)胞的增殖、存活、分化及血管生成等生命過程，設(shè)計(jì)篩選該信號通路的特異性抑制劑對癌癥的臨床治療具有非常重要的實(shí)際意義[6-7]。本研究檢測PI3K/mTOR雙重抑制劑PF-04691502對SGC-7901細(xì)胞增殖及凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)PF-04691502抑制了胃癌細(xì)胞的生存力，且抑制作用呈劑量依賴性(圖1)。流式結(jié)果表明PF-04691502誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞阻滯于G1期，其機(jī)制與PF-04691502抑制SGC-7901細(xì)胞中cyclin D1的蛋白水平，增加了p21的表達(dá)相關(guān)。

化合物的抗癌活性與腫瘤細(xì)胞的凋亡關(guān)系密切[8]。本研究檢測了PF-04691502對SGC-7901細(xì)胞凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)PF-04691502可誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞發(fā)生明顯的凋亡現(xiàn)象。細(xì)胞凋亡的執(zhí)行可以通過內(nèi)源性和外源性2條途徑執(zhí)行。在內(nèi)源性的凋亡途徑中，細(xì)胞色素C 與凋亡蛋白酶活化因子1(Apaf-1)促使pro-caspase-9 與兩者結(jié)合形成凋亡小體同時(shí)活化caspase-9；激活的caspase-9 又活化caspase-3，將PARP切割成小片段，使PARP的活性喪失[9-10]。在本研究中，胃癌細(xì)胞SGC-7901 經(jīng)PF-04691502作用24 h后，促進(jìn)procaspase-9 和procaspase-3剪接成有活性的caspase-9 和caspase-3。在外源性細(xì)胞凋亡信號通路中，細(xì)胞通過激活的死亡受體招募接頭蛋白Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白(FADD)，F(xiàn)ADD進(jìn)而募集并激活caspase-8從而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，caspase-8的切割產(chǎn)物隨著PF-04691502濃度的增加而增多(圖5) 。

Figure 4. PF-04691502 induced apoptosis of SGC-7901 cells. Cells were incubated with the indicated concentrations of PF-04691502 for 24 h, and the apoptosis was determined by Annexin V/PI staining analysis. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L.

圖4AnnexinV/PI檢測PF-04691502對SGC-7901胃癌細(xì)胞凋亡的影響

Figure 5. PF-04691502 treatment activated the cleavage of caspase-3, caspase-8, caspase-9 and PARP in SGC-7901 cells．CF:cleaved fragment.

圖5PF-04691502對caspases家族主要蛋白因子和PARP活性切割的影響

總之，PF-04691502能夠抑制SGC-7901胃癌細(xì)胞的增殖，阻滯細(xì)胞于G1期；PF-04691502可通過激活caspases的活性切割而誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞發(fā)生凋亡現(xiàn)象。本研究為PF-04691502用于胃癌的臨床治療提供了理論基礎(chǔ)與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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PI3K/mTORdualinhibitorPF-04691502inducesapoptosisofhumangastriccancerSGC-7901cells

FEI Hong-rong1, ZHAO Ying1, WANG Gui-ling1, QU Xiao-lan1, WANG Feng-ze2,3

(1SchoolofPharmacy,2SchoolofBiologicalSciences,3InstituteofMedicinalBiotechnology,TaishanMedicalUniversity,Taian271016,China.E-mail:wfz221@sina.com.cn)

AIM: To determine the antitumor effect of PF-04691502, a dual inhibitor of phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/Akt and mammalian target of rapamycin (mTOR), on the viability and apoptosis of human gastric cancer cell line SGC-7901.METHODSCell viability was analyzed by MTT assay. Cell cycle was detected by flow cytometry, and Annexin V-FITC/PI dual staining was used to detect cell apoptosis. Protein expression of p21, cyclin D1, caspase-3, caspase-8, caspase-9 and poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) was determined by Western blotting.RESULTSMTT assay and cell cycle analysis results indicated that PF-04691502 inhibited the viability of SGC-7901 cells in a dose-dependent manner, and arrested the cells in G1phase. PF-04691502 down-regulated the expression of cyclin D1 and up-regulated the expression of p21. In addition, SGC-7901 cells treated with PF-04691502 showed typical characteristics of apoptosis, accompanied by activation of caspases and cleavage of PARP.CONCLUSIONThe PI3K/mTOR dual inhibitor PF-04691502 induces the apoptosis and inhibited the growth of SGC-7901 cells, implicating its potential therapeutic value for the treatment of cancer.

PF-04691502; PI3K/mTOR; Cell proliferation; Apoptosis; Caspases

R966

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.11.008

1000- 4718(2013)11- 1962- 04

2013- 06- 04

2013- 07- 15

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81272683)； 山東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. ZR2011HQ034)

△通訊作者 Tel: 0538-6236075； E-mail:wfz221@sina.com.cn