胡偉毅， 邵套喜

(1.連云港出入境檢驗(yàn)檢疫局，江蘇連云港 222042； 2.江蘇省贛榆縣塔山鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)技術(shù)服務(wù)中心，江蘇連云港 222123)

matK序列作為DNA條形碼在蒼耳屬中的應(yīng)用

胡偉毅1， 邵套喜2

(1.連云港出入境檢驗(yàn)檢疫局，江蘇連云港 222042； 2.江蘇省贛榆縣塔山鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)技術(shù)服務(wù)中心，江蘇連云港 222123)

以matK序列作為DNA條形碼，對(duì)從國外截獲的7種蒼耳屬植物進(jìn)行物種區(qū)分鑒定研究，采用DNeasy? Plant Mini Kit試劑盒進(jìn)行總DNA的提取，應(yīng)用通用引物對(duì)其matK基因進(jìn)行擴(kuò)增，測(cè)序得到7種蒼耳屬植物的matK序列，利用MEGA 5.1軟件對(duì)這7種蒼耳屬植物的matK序列進(jìn)行比對(duì)和分析并構(gòu)建系統(tǒng)樹，結(jié)果顯示：matK序列能從基因位點(diǎn)層面對(duì)蒼耳屬植物進(jìn)行區(qū)分鑒定。

matK序列；DNA條形碼；蒼耳屬

蒼耳屬(Xanthium)植物為農(nóng)田中的主要雜草，且可黏附于動(dòng)物毛皮上，從而降低毛皮的品質(zhì)，影響動(dòng)物的健康，因此在2006年發(fā)布的農(nóng)業(yè)部與國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局共同制定的《中華人民共和國進(jìn)境植物檢疫性有害生物名錄》中，將所有的蒼耳屬(非中國種)植物都列為檢疫性有害生物，防止其進(jìn)入我國，危害我國農(nóng)業(yè)生態(tài)安全。近年來，隨著我國檢驗(yàn)檢疫鑒定技術(shù)的提高，許多蒼耳屬(非中國種)植物都被鑒定到種，但是蒼耳屬植物的形態(tài)鑒定手段對(duì)實(shí)驗(yàn)室鑒定經(jīng)驗(yàn)有著較高的要求，而且蒼耳屬的果實(shí)在糧谷的長期運(yùn)輸中難免會(huì)受到磨損，因此檢驗(yàn)檢疫工作的一線工作人員有必要尋求新技術(shù)、新方法的支持。

植物DNA條形碼技術(shù)是針對(duì)植物基因組中的特定基因進(jìn)行片段擴(kuò)增、測(cè)序并發(fā)現(xiàn)其堿基變化規(guī)律的技術(shù)手段，其概念由加拿大科學(xué)家Paul Hebert于2003年正式提出[1]，該技術(shù)在動(dòng)物的COI基因中應(yīng)用較為成熟[2-4]，但由于COI基因在植物中變化保守，不能起到很好的區(qū)分作用，使得植物DNA條形碼技術(shù)的研究重點(diǎn)仍在通用基因片段的應(yīng)用、篩選、搭配上[5]。盡管如此，植物DNA條形碼技術(shù)仍在保護(hù)瀕危物種、藥品食品監(jiān)督、中草藥資源鑒定及生態(tài)學(xué)調(diào)查等諸多領(lǐng)域中起到了突破性的作用，發(fā)揮了以前形態(tài)學(xué)研究所無法產(chǎn)生的威力[6-8]。matK序列是編碼成熟酶K蛋白的基因，是國際生物條形碼聯(lián)盟(CBOL)推薦的植物DNA條形碼核心序列[9]。本試驗(yàn)以2012年連云港口岸截獲的7種蒼耳屬植物為研究對(duì)象，探討其matK序列變化規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

7種蒼耳屬植物：北美蒼耳(Xanthiumchinese)、蒼耳(Xanthiumsibiricum)、刺蒼耳(Xanthiumspinosum)、西方蒼耳(Xanthiumoccidentale)、巴西蒼耳(Xanthiumbrasilicum)、美麗蒼耳(Xanthiumspeciosum)、賓州蒼耳(Xanthiumpensylvanicum)。以上外來蒼耳均為2012年在進(jìn)口大豆中截獲，并由中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)院鑒定的樣本；DNeasy? Plant Mini Kit、2×Taqmaster mix、瓊脂糖、Golden View Ⅰ(GV Ⅰ)等試劑耗材。

matK引物[10]：matKf：5′-C G A T C T A T T C A T T C A A T A T T T C-3′；matKr：5′-T C T A G C A C A C G A A A G T C G A A G T-3′。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA的提取 采用DNeasy? Plant Mini Kit試劑盒法提取DNA，按照說明書逐步操作，可得到200 μL DNA樣品，-20 ℃冰箱保存。

1.2.2 PCR反應(yīng)體系 PCR反應(yīng)使用中美泰和公司2×Taq master mix進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)采用25μL體系：DNA模板，3μL；引物1，1μL；引物2，1μL；2×Taq master mix，12.5 μL；ddH2O，7.5μL。

1.2.3 PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件 95 ℃，4 min；94 ℃、45 s，52 ℃、1.5 min，72 ℃、1.5 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃、10 min；4 ℃保存。

1.2.4 瓊脂糖凝膠置備 稱取1.5 g 瓊脂糖 G-10于錐形瓶中，分別加入100 mL ddH2O、2 mL 50×TAE buffer，高火微波 4 min，將錐形瓶置于75 ℃水浴中5 min；再加入 10 μL GV Ⅰ，搖勻后靜置10 min，倒入凝膠模具中，放置 30 min 后使用。

1.2.5 電泳 取4 μL PCR產(chǎn)物點(diǎn)樣電泳，100 V，45 min。將凝膠放入凝膠成像系統(tǒng)拍照，得到電泳結(jié)果圖(圖1)。與Marker對(duì)比可知，改擴(kuò)增產(chǎn)物大小接近 750 bp，符合預(yù)期。

1.2.6 測(cè)序及拼接 將PCR產(chǎn)物送往中美泰和生物技術(shù)(北京)有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果用CodenCode Aligner軟件對(duì)其剪切和拼接，得到完整序列。

2 結(jié)果分析

2.1 BLAST檢測(cè)

登陸NCBI，將拼接后的序列進(jìn)行BLAST檢測(cè)，證明7種蒼耳屬植物的matK序列擴(kuò)增及測(cè)序成功。

2.2 ClustalW校對(duì)

利用MEGA5.1軟件[11]對(duì)7種蒼耳屬植物進(jìn)行ClustalW校對(duì)，校對(duì)后的序列繼續(xù)用MEGA5.1進(jìn)行分子進(jìn)化遺傳分析。

2.3 堿基構(gòu)成分析

從表1可以看出，蒼耳屬植物matK序列的T、A、G、C堿基的變化范圍依次減小，分別為8.6%、7.9%、1.5%、0.3%。其中T堿基含量最高的是刺蒼耳，為37.8%，最低的是西方蒼耳，為29.2%；A堿基含量最高的是西方蒼耳，為37.2%，最低的是為巴西蒼耳、北美蒼耳，均為29.3%；G堿基含量最高的是蒼耳，為17.5%，最低的是賓州蒼耳，為16.0%；C堿基含量最高的是賓州蒼耳，為16.9%，最低的是西方蒼耳、蒼耳，均為16.6%。

2.4 基因位點(diǎn)分析

由MEGA5.1測(cè)算可知，蒼耳屬植物matK序列共有927個(gè)位點(diǎn)，其中保守位點(diǎn)有422個(gè)、變異位點(diǎn)505個(gè)，變異位點(diǎn)中單突變位點(diǎn)有19個(gè)(表2)。

2.5 遺傳距離分析

利用MEGA5.1軟件，采用Tajima-Nei模型計(jì)算遺傳距離，得到表3，可以看出，蒼耳屬植物matK序列的遺傳距離最高值為2.553 3，為蒼耳與美麗蒼耳的遺傳距離；最小值為0.000 0，為巴西蒼耳與北美蒼耳的距離。這說明雖然巴西蒼耳與北美蒼耳單從序列上看，于33、904、916位點(diǎn)存在有位點(diǎn)的插入缺失差異，但在Tajima-Nei模型中被忽略不計(jì)，所從遺傳距離上無法區(qū)分。

2.6 系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹

利用MEGA5.1軟件，采用Neighbor-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)，可以看出：蒼耳、西方蒼耳被分為一支；賓州蒼耳被分為一支；巴西蒼耳、北美蒼耳、刺蒼耳、美麗蒼耳被分為一支；對(duì)其進(jìn)行bootstrap檢驗(yàn)，其分組支持率為100%，說明這3支蒼耳屬植物在系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育中是相互獨(dú)立的。巴西蒼耳、北美蒼耳、刺蒼耳、美麗蒼耳這一支又被劃分為不同級(jí)別的分支，但是其bootstrap檢驗(yàn)支持率最高僅為47%，說明從植物matK序列進(jìn)化層面講，這4種蒼耳屬植物在蒼耳屬系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育中的獨(dú)立性相對(duì)較弱。

表1 蒼耳屬植物matK序列堿基構(gòu)成Table 1 The matK sequence base composition of Xanthium plants

表2 蒼耳屬植物matK序列單突變位點(diǎn)Table 2 The matK sequence single mutations of Xanthium plants

表3 蒼耳屬植物matK序列遺傳距離Table 3 The matK sequence genetic distance of Xanthium plant

3 討論

外來雜草對(duì)我國產(chǎn)生了嚴(yán)重危害[12]，對(duì)外來雜草種子的鑒定工作一直以來都是進(jìn)境糧谷檢驗(yàn)檢疫工作的重點(diǎn)。但是由于雜草種子在糧谷的長期運(yùn)輸中難免會(huì)受到磨損，從而不具備鑒定到物種的足夠信息，而進(jìn)口貨物的檢驗(yàn)檢疫周期又有一定的時(shí)間要求，這就使得外來雜草種子的鑒定工作成為糧谷檢驗(yàn)檢疫工作的難點(diǎn)。解決這個(gè)問題亟需加強(qiáng)檢驗(yàn)檢疫系統(tǒng)與各個(gè)科研院所的合作，引進(jìn)新的科技手段。本試驗(yàn)就是將DNA條形碼鑒定手段應(yīng)用到來自世界各地的蒼耳屬植物中，從試驗(yàn)結(jié)果來看，matK序列能從基因位點(diǎn)層面對(duì)蒼耳屬植物進(jìn)行區(qū)分，但是也存在有以下不足：(1)巴西蒼耳與北美蒼耳在matK序列僅存在基因位點(diǎn)插入缺失的差異；(2)matK序列對(duì)巴西蒼耳、北美蒼耳、刺蒼耳、美麗蒼耳這一系統(tǒng)發(fā)育支系的繼續(xù)分化沒有提供較高的支持值。在植物DNA條形碼的研究中，trnH-psbA、rbcL、ITS、ITS2等基因序列也是研究工作的重點(diǎn)，或許對(duì)matK序列可以起到補(bǔ)充作用[13-14]。

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TheapplicationofmatKsequenceasDNAbarcodeinXanthium

HU Wei-yi1，SHAO Tao-xi2

(1.Lianyungang Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Lianyungang 222042，China；2.Ganyu Tashan Agricultural Technology Service Center，Ganyu222042，China)

MatK sequence was used as DNA barcode to distinguish and indentify seven plant species in the genusXanthiumof foreign origin. DNeasy? Plant Mini Kit was used to extract the total DNA. A universal primer was used to amplify matK genes for sequencing. The matK sequences of the sevenXanthiumspecies were contrasted and analyzed by MEGA 5.1 software，and a phylogenetic tree was constructed. The matK sequences were able to distinguish and indentifyXanthiumplants at the gene level.

matK sequence；DNA barcode；Xanthium

S41-30

A

1003-935X(2013)04-0013-04

胡偉毅，邵套喜. matK序列作為DNA條形碼在蒼耳屬中的應(yīng)用[J]. 雜草科學(xué)，2013，31(4)：13-16.

2013-09-13

江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局科技項(xiàng)目(編號(hào)：2012KJ54)。

胡偉毅(1984—)，男，碩士，主要從事港口外來有害生物截獲工作。E-mail：94087540@qq.com。