諸愛士

(浙江科技學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院，杭州 310023)

葛根黃酮提取工藝優(yōu)化

諸愛士

(浙江科技學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院，杭州 310023)

為研究葛根黃酮的提取工藝，對(duì)多個(gè)影響因素進(jìn)行了單因素考察，并選擇乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、液固比與提取溫度4個(gè)因素采用響應(yīng)面法進(jìn)行了優(yōu)化，建立了數(shù)學(xué)模型并進(jìn)行了方差分析。結(jié)果表明，所得模型能很好地描述提取率與各因素之間的關(guān)系，黃酮提取的最佳工藝為：乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)63.9 %、提取時(shí)間138.0 min、液固比11.3 mL/g、提取溫度72.9 ℃、1次提??；提取時(shí)溶液pH值不需調(diào)整；乙醇回收循環(huán)使用可行。采用該工藝條件，黃酮理論提取率可達(dá)到1 842.6 μg/g，實(shí)際為1 821.3 μg/g。

葛根；黃酮；提取工藝；響應(yīng)面法；工藝優(yōu)化

葛根是一種富含異黃酮的食用草本植物，以“葛根”的條目被正式列入2010年版中國藥典，在傳統(tǒng)中藥中廣泛使用，常被用作解熱劑、發(fā)汗劑、止吐劑等；另外，葛根還具有改善血液循環(huán)、解痙、降血糖等功效[1-5]。理化分析發(fā)現(xiàn)，發(fā)揮這些效用的主要活性成分是異黃酮(葛根素、大豆苷)，因此對(duì)黃酮的提取也隨之受到許多研究者的關(guān)注。許多因素，如提取劑種類與含量、提取時(shí)間、液固比、提取溫度、體系酸堿度、提取次數(shù)等都會(huì)影響提取過程，不同的變量會(huì)對(duì)這個(gè)過程有不同的影響，并且因素之間可能還會(huì)有相互作用。然而，傳統(tǒng)的優(yōu)化多因素系統(tǒng)的方法實(shí)驗(yàn)數(shù)量大，非常耗時(shí)，也難于分析因素之間存在的相互作用，很難找到真正最佳條件。響應(yīng)面方法(RSM)可以有效地用于評(píng)估多因素的影響和它們對(duì)一個(gè)或多個(gè)響應(yīng)值的相互作用，既可以通過合理的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)減少實(shí)驗(yàn)數(shù)量，又可以通過建立數(shù)學(xué)模型優(yōu)化出可能處于所考察點(diǎn)之間的最佳條件[6]。本實(shí)驗(yàn)研究了葛根黃酮的提取工藝，系統(tǒng)研究了提取劑—乙醇水溶液的乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、液固比(萃取液體積與葛根質(zhì)量之比，mL/g，全文同)、提取溫度、溶液pH值、提取次數(shù)及回收乙醇等對(duì)黃酮提取率的影響。在單因素研究基礎(chǔ)上，對(duì)乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、液固比、提取溫度4個(gè)因素，進(jìn)行3水平的響應(yīng)面法優(yōu)化，得到提取率與因素間關(guān)系的數(shù)學(xué)模型，可為工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

原料：葛根，粉狀(100目)，重慶慧遠(yuǎn)藥業(yè)有限公司。

主要試劑：蘆丁(標(biāo)準(zhǔn)品，中國醫(yī)藥(集團(tuán))上?；瘜W(xué)試劑公司)，亞硝酸鈉(分析純，上海振欣試劑廠)；硝酸鋁(分析純，上海振欣試劑廠)，氫氧化鈉(分析純，杭州蕭山化學(xué)試劑廠)，鹽酸(分析純，杭州化學(xué)試劑有限公司)，乙醇(分析純，杭州長征化學(xué)試劑有限公司)。

主要儀器：DHG-9123A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司),BS124S型電子天平(北京塞多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)，DK-S24電熱恒溫水浴鍋(上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司)，SHZ-ⅢB型循環(huán)水真空泵(浙江臨海市精工真空設(shè)備廠)，722E型可見分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黃酮的提取

將恒溫水浴鍋設(shè)置到需要的溫度，稱取5.0 g于60 ℃干燥箱已恒質(zhì)量的葛根置于500 mL燒瓶中，加入某一體積某一質(zhì)量分?jǐn)?shù)的乙醇水溶液，潤濕搖勻后將燒瓶固定于恒溫水浴，裝上回流冷凝管，提取某一時(shí)間。提取結(jié)束后對(duì)混合料液進(jìn)行真空過濾，得濾液；測(cè)定濾液體積，取樣按標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定吸光度；計(jì)算溶液中的黃酮含量及黃酮的提取率。

研究不同乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、液固比、提取溫度、溶液pH值、提取次數(shù)、回收乙醇等因素對(duì)黃酮提取率的影響。在此基礎(chǔ)上，選擇相關(guān)因素進(jìn)行響應(yīng)面法優(yōu)化。

1.2.2 分析方法

黃酮含量采用硝酸鋁-亞硝酸鈉法在波長506 nm下測(cè)定，用蘆丁質(zhì)量濃度表示[3,7]。

實(shí)驗(yàn)得到吸光度與黃酮質(zhì)量濃度的關(guān)系為：

A=0.004 6C-0.003 4

(1)

式(1)中：A—506 nm處溶液吸光度；C—黃酮的質(zhì)量濃度，μg/mL。

1.2.3 提取率表達(dá)

葛根黃酮的提取率Y依照式(2)計(jì)算：

(2)

式(2)中：V—濾液體積，mL；m—葛根取樣量，g；Y—黃酮的提取率，μg/g。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素考察及其分析

2.1.1 乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)提取率的影響

設(shè)定提取溫度80 ℃、液固比12 mL/g、提取液原始酸堿度pH 7、1次提取120 min，分別考察萃取劑乙醇水溶液的乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%、50%、70%、90%、100%時(shí)黃酮提取率的變化，結(jié)果見圖1。

圖1 乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)提取率的影響Fig.1 Effects of quality fraction of ethanolon extraction yield

圖1顯示，隨著乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)從30%增大至70%，黃酮提取率也隨之增大，到70%達(dá)到最大值，而乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)一步增大，反而使提取率快速減小。這是由于葛根黃酮分子結(jié)構(gòu)的特殊性所致，結(jié)構(gòu)中既有易溶于水的葡萄糖基又有易溶于醇的羥基，在乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低時(shí)，易溶于乙醇的成分未被完全提取，當(dāng)乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高時(shí)，又會(huì)使易溶于水的成分未被完全提取，或者兼而有之時(shí)牽引力不足于將有效成分轉(zhuǎn)移至提取液中[8]。因此，當(dāng)乙醇與水的比例達(dá)到適宜時(shí)，會(huì)使提取率最高。對(duì)于葛根黃酮提取，在以上條件下70%為最佳乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

2.1.2 提取時(shí)間對(duì)提取率的影響

圖2 提取時(shí)間對(duì)提取率的影響Fig.2 Effects of extraction time on extraction yield

在乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)70%、液固比12 mL/g、提取溫度80 ℃、pH 7條件下對(duì)葛根分別1次提取30、60、90、120、150 min，黃酮提取率的結(jié)果見圖2。

圖2表明，隨著提取時(shí)間的延長，黃酮提取率先明顯增大，到120 min時(shí)增速變緩，趨于平穩(wěn)。傳質(zhì)過程具有一定的速度，要使黃酮從葛根中完全傳遞至提取液中需要一定的時(shí)間，又由于傳質(zhì)推動(dòng)力逐漸變小，使得到一定時(shí)間后，傳質(zhì)趨于平衡，凈的傳遞量不再增加，有時(shí)還會(huì)由于分解而使提取率降低；而提取時(shí)間延長亦會(huì)增加操作成本。綜合考慮各因素，認(rèn)為提取時(shí)間120 min比較合理。

2.1.3 液固比對(duì)提取率的影響

圖3 液固比對(duì)提取率的影響Fig.3 Effects of liquid-solid ratio on extraction yield

由于液固比的大小是決定傳質(zhì)推動(dòng)力的重要因素，直接影響提取效果，所以進(jìn)行了不同液固比的對(duì)比實(shí)驗(yàn)，其他條件如下：乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)70%、提取時(shí)間120 min、提取溫度80℃、pH 7、1次提取，所得結(jié)果見圖3。

從圖3可以看出，液固比從4 mL/g增大至10 mL/g，提取率幾乎成線性增大，液固比到10 mL/g后再增大至12 mL/g，圖線幾乎水平，說明提取率增大有限。增大液固比即減小了液體的黃酮濃度，加大了兩相間的濃度差。液固比到一定值后，由于葛根中的黃酮幾乎全部被提出，使得再增大液固比，提取率不再有明顯提高。從工業(yè)角度來考慮，液固比大，會(huì)使設(shè)備與操作成本增大，故就該現(xiàn)象而言，合適的液固比應(yīng)取10 mL/g。

2.1.4 提取溫度對(duì)提取率的影響

圖4 提取溫度對(duì)提取率的影響Fig.4 Effects of extraction temperature onextraction yield

固定乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)70%、提取時(shí)間120 min、液固比10 mL/g、pH 7、提取1次，比較了不同的提取溫度對(duì)黃酮提取率的影響，結(jié)果見圖4。

溫度的影響具有雙重性，升高溫度可以降低液體黏度，使傳質(zhì)阻力減小，同時(shí)可以促進(jìn)分子熱運(yùn)動(dòng)，提高擴(kuò)散系數(shù)，并增加溶質(zhì)的溶解度，兩者均加快了傳質(zhì)速度，有利于提取率的提高；但溫度的升高又會(huì)使物質(zhì)分解變性，降低提取率[9]。圖4證實(shí)了這一點(diǎn)，并看到在70 ℃下提取率出現(xiàn)最高點(diǎn)，溫度過低或過高均會(huì)使提取率減小，所以70 ℃有利于葛根黃酮的提取。

2.1.5 溶液pH值對(duì)提取率的影響

圖5 pH值對(duì)提取率的影響Fig.5 Influence of pH on extraction yield

原始的提取體系酸堿度在7左右，為了研究體系的酸堿度對(duì)黃酮提取率的影響，用酸或堿調(diào)整體系的pH值，比較了在不同的酸堿環(huán)境下的提取效果，結(jié)果見圖5。其他條件為乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)70%、提取時(shí)間120 min、液固比10 mL/g、提取溫度70 ℃、提取1次。

研究發(fā)現(xiàn)，pH值在7附近提取率最大，體系酸性對(duì)提取率影響不大，而體系堿性會(huì)使提取率明顯降低，這可能是在酸性條件下酸中和了黃酮中堿性成分形成鹽而在堿性加熱的條件下黃酮類化合物母核被破壞所致。因此葛根黃酮提取時(shí)無須調(diào)整體系的酸堿度。

2.1.6 提取次數(shù)對(duì)提取率的影響

葛根提取1次黃酮后，由于固液兩相濃度達(dá)到平衡使固相中的黃酮有可能沒有被完全提出，所以在乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)70%、提取時(shí)間120 min、液固比10 mL/g、提取溫度70 ℃、pH 7下進(jìn)行第二次提取，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果第二次提取的平均提取率僅為第一次的2.9%。雖提取2次提高了黃酮提取率，但操作費(fèi)成倍增加，因此基于工業(yè)化生產(chǎn)，可行的方案仍是提取1次。

2.1.7 回收乙醇對(duì)提取率的影響

提取劑中的乙醇提取過黃酮后，有少量乙醇被葛根浸潤而帶走，大量乙醇仍留于提取液中，獲得黃酮后將其廢棄浪費(fèi)嚴(yán)重且污染環(huán)境，工業(yè)化生產(chǎn)肯定不行。基于此，實(shí)驗(yàn)探討了提取液中乙醇的減壓蒸發(fā)回收，并將回收液重新配制成所需乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提取劑用于提取，即乙醇的循環(huán)使用，使實(shí)驗(yàn)室研究更接近于工程。結(jié)果得到乙醇回收率可達(dá)94.3%，其損失除上面提到的外，還有提取、回收系統(tǒng)密封性不夠所造成的損失。采用回收乙醇用于提取時(shí)黃酮的提取率比用新鮮乙醇的平均低1.7%，這說明乙醇回收循環(huán)使用可行。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝

2.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

由于單因素考察時(shí)水平取值有一定的步長，所得最佳水平不一定是真實(shí)的最好水平，為了進(jìn)一步優(yōu)化條件，以單因素考察所得最佳水平為中心，以黃酮提取率為響應(yīng)值Y(μg/g)，選取乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、液固比和提取溫度4個(gè)因素，采用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，進(jìn)行4因素3水平的響應(yīng)面法優(yōu)化。 實(shí)驗(yàn)因素見表1，所得結(jié)果見表2。

表1 實(shí)驗(yàn)因素水平編碼Table 1 Codes and levels of experimental factors

表2 實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果分析

2.2.2 模型擬合與方差分析

將各實(shí)驗(yàn)的提取率用Design-Expert7.1.6軟件進(jìn)行處理，得到了用因素實(shí)際值表示的葛根黃酮提取率與各因素間關(guān)系的數(shù)學(xué)模型：

Y=-8 625.454+68.657X1+6.875X2+299.438X3+167.598X4+0.025X1X2+

0.131X1X3+0.019X1X4+0.213X2X3-0.004X2X4+1.125X3X4-

(3)

方差分析的結(jié)果見表3。由表3中數(shù)據(jù)可得，模型的F值為97.17、p<0.000 1、R2=0.989 8、Adj.R2=0.979 6與Pred.R2=0.944 1，這些均說明由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)所擬合的模型能很好地描述提取率與各因素間的關(guān)系，由此模型可以預(yù)測(cè)考察范圍內(nèi)其他條件下的提取率。X1、X2、X3、X4與X12、X32、X42對(duì)Y的影響非常顯著(p<0.000 1)；X22對(duì)Y的影響顯著(p<0.05)；而4因素間的6項(xiàng)交互項(xiàng)對(duì)Y的影響不顯著(p>0.05)；這些說明因素對(duì)提取率的影響不是簡單一次項(xiàng)關(guān)系。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance for regression equation

2.2.3 最優(yōu)值與響應(yīng)面描述

由Design-Expert7.1.6程序可預(yù)測(cè)到在X1=63.8%、X2=138.0 min、X3=11.3 mL/g、X4=72.9 ℃條件下有1 842.6 μg/g的最大黃酮提取率。

固定其中兩個(gè)因素于0位，另兩個(gè)因素的3D圖見圖6。

圖6(a、b、c)顯示，乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)提取率的影響比提取時(shí)間、液固比與提取溫度顯著，具有相同的趨勢(shì)，即提取率均先隨乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)增大而升高，到某一點(diǎn)出現(xiàn)最大值，而后隨乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的繼續(xù)增大出現(xiàn)急劇下降；其他三因素的影響強(qiáng)弱依次是提取溫度、液固比、提取時(shí)間，并且提取時(shí)間與液固比的影響不像單因素考察時(shí)的趨勢(shì)，而顯示出有交互影響。圖6(d)表明提取率有隨提取時(shí)間或液固比增大而先升高后降低的現(xiàn)象，但液固比的影響明顯大于提取時(shí)間。圖6(e)描述了與圖6(d)相類似的結(jié)果，提取溫度的影響比提取時(shí)間的大。圖6(f)的圖形與圖6(e)相像，說明具有相似的作用，不過提取溫度對(duì)提取率的作用稍強(qiáng)于液固比。

2.2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

在乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)63.8%、提取時(shí)間138.0 min、液固比11.3 mL/g、提取溫度72.9 ℃的條件下進(jìn)行3次平行提取實(shí)驗(yàn)，測(cè)得平均提取率為1 821.3 μg/g (n=3，RSD=9.1‰)，與1 842.6 μg/g的預(yù)測(cè)值相比，相對(duì)誤差是-1.16%，說明所得模型能比較準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)葛根黃酮提取實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

3 結(jié) 語

單因素考察發(fā)現(xiàn)：乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、液固比、提取溫度等因素對(duì)葛根黃酮提取率有非常顯著的影響，中性條件有利于提取，提取1次就基本完全，回收的乙醇循環(huán)使用基本不影響提取效果。

葛根黃酮提取的理想條件是：乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)63.8%、提取時(shí)間138.0 min、液固比11.3 mL/g、提取溫度72.9 ℃、體系原有的酸堿度下提取1次，預(yù)測(cè)最大提取率為1 842.6 μg/g，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得到實(shí)際提取率為1 821.3 μg/g，相對(duì)誤差是-1.16%。

(a)Y=f(X1,X2)的響應(yīng)面(X3=10 mL/g，X4=70 ℃)

(b)Y=f(X1,X3)的響應(yīng)面(X2=120 min，X4=70 ℃)

(c)Y=f(X1,X4)的響應(yīng)面(X2=120 min，X3=10 mL/g)

(d)Y=f(X2, X3)的響應(yīng)面(X1=70%，X4=70 ℃)

(e)Y=f(X2,X4)的響應(yīng)面(X1=70%，X3=10 mL/g)

(f)Y=f(X3,X4)的響應(yīng)面(X1=70%，X2=120 min)

[1] 李杏元,陳國安.微波輔助提取葛根黃酮工藝的優(yōu)化[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,51(16):3572-3574.

[2] 雷小丹,邱朝坤,劉曉宇,等.葛根黃酮提取工藝條件優(yōu)化的響應(yīng)面分析[J].食品科技,2011,36(9):223-226.

[3] 張喜梅,李琳,陳玲,等.葛根總黃酮提取工藝研究[J].現(xiàn)代食品科技,2008,24(1):42-45.

[4] Fan J P, Cao J, Zhang X H, et al. Optimization of ionic liquid based ultrasonic assisted extraction of puerarin from Radix Puerariae Lobatae by response surface methodology [J]. Food Chemistry,2012,135(4):2299-2306.

[5] Cai R L, Li M, Xie S H, et al. Antihypertensive effect of total flavone extracts from Puerariae Radix [J]. Journal of Ethnopharmacology,2011,133(1):177-183.

[6] Xu Q, Shen Y Y, Wang H F, et al. Application of response surface methodology to optimise extraction of flavonoids from fructus sophorae[J]. Food Chemistry,2013,138(4):2122-2129.

[7] Shan B, Xie J H, Zhu J H, et al. Ethanol modified supercritical carbon dioxide extraction of flavonoids from Momordica charantia L. and its antioxidant activity[J]. Food and Bioproducts Processing,2012,90(3):579-587.

[8] 陳鋼,蘇同福,趙士舉.萃取劑的極性對(duì)葛根總黃酮提取率影響的研究[J].河南科學(xué),2012,30(11):1585-1588.

[9] 諸愛士,葉金娜,嚴(yán)飛娜.均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化小米多糖提取工藝[J].浙江科技學(xué)院學(xué)報(bào),2013,25(1):27-32.

Optimumextractingtechnologyofflavonoidsfromradixpueraria

ZHU Aishi

(School of Biological and Chemical Engineering, Zhejiang University of Science andTechnology, Hangzhou 310023, China)

The multiple influence factors were investigated through the single factor for researching the extraction technology of flavonoids from radix pueraria. Four factors of quality fraction of ethanol, extraction time, liquid-solid ratio and extraction temperature were chosen to optimize with response surface methodology(RSM). A mathematical model was established and the analysis of variance was carried out. The result shows that the obtained model is significant and the optimum extraction conditions are as follows: 63.9 % of quality fraction of ethanol, 138.0 min of extraction time, 11.3 mL/g of liquid-solid ratio, 72.9 ℃ of extraction temperature and one time extraction; when extracting the pH value of solution does not need to adjust; the recycle use of ethanol is feasible. Using the process conditions, the theoretical extraction yield of flavonoids is 1 842.6 μg/g; the practical extraction yield is 1 821.3 μg/g.

radix pueraria; flavonoids; extraction technology; response surface methodology; technology optimization

10.3969/j.issn.1671-8798.2013.05.009

2013-05-02

諸愛士(1966— )，男，浙江省湖州人，副教授，主要從事化工傳遞與農(nóng)產(chǎn)品加工的教學(xué)與研究。

TQ028.96; TS201.2

A

1671-8798(2013)05-0366-07