張福華，尹 麗

(漯河醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，河南漯河 462002)

銀杏作為我國特有的物種，含有很多活性物質(zhì)。銀杏葉、銀杏外種皮、白果、銀杏花粉等都有提取銀杏活性物質(zhì)的報道。研究發(fā)現(xiàn)，銀杏中的有效成分可以有效抗氧化、清除自由基、抑菌、增強小鼠免疫功能、保護(hù)四氯化碳引起的肝損傷等作用［1～3］。目前關(guān)于銀杏多糖的提取研究很多，并已經(jīng)得到晶體［4］。研究發(fā)現(xiàn)，銀杏多糖有一定的抗氧化能力［5～7］，但關(guān)于銀杏多糖的體內(nèi)實驗甚少。本實驗主要研究銀杏多糖對四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠肝損傷的保護(hù)作用，揭示其機制并為進(jìn)一步的研究提供參考。

1 材料

1.1 材料與試劑

銀杏葉(11月份，采自漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校校園內(nèi))經(jīng)漯河醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校任亮副教授鑒定為銀杏樹(Ginkgo Biloba)的葉。谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)試劑盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、谷胱甘肽過氧化酶(GSH-Px)試劑盒均購自南京建成生物研究所。NO TNF-α試劑盒購自武漢博士德有限公司，聯(lián)苯雙酯購自北京協(xié)和藥廠，CCl購自上海申鶴化學(xué)品有限公司，其他試劑均為市售分析純。

1.2 動物

昆明小鼠共60只(雌雄各半)，體質(zhì)量20±2 g，由河南省實驗動物中心提供(許可證號 SCXK(豫)2005-008)。

1.3 儀器設(shè)備

RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)，722s分光光度儀(上海第三分析儀器廠)，HH-8數(shù)顯恒溫水浴鍋(國華電器有限公司)，ZS83-1型內(nèi)切式組織勻漿機(浙西機械廠)，CKX41熒光倒置顯微鏡(Olympus公司)，DU640紫外可見分光光度計(Backman，美國)。

2 方法

2.1 銀杏多糖的提取［8，9］

取銀杏葉1000g蒸餾水洗凈80℃烘干12h，取出粉碎過80目篩。取烘干品100g加入15倍體積蒸餾水，75℃下水浴浸提5h，浸提2次，合并2次濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀60℃直到體積為原體積的1/3。然后濃縮液3000rpm離心20min，加入3000ml 95%乙醇，靜置24 h收集沉淀。用蒸餾水反復(fù)洗滌，然后用Sevag方法去除沉淀中蛋白質(zhì)，在核酸最大吸收波長260nm、蛋白質(zhì)最大吸收波長280nm進(jìn)行檢測，無明顯吸收峰。再用無水乙醇脫水，之后用乙醚洗滌脫脂，最終得到灰白色銀杏多糖粗制品。經(jīng)稱量4.15g，得率為4.15%，用時稀釋。

2.3 動物分組與藥物處理

60只昆明小鼠隨機分為6組，分別為空白組、模型組、聯(lián)苯雙酯組、銀杏多糖高、中、低劑量組，每組10只。其中，銀杏多糖低、中、高劑量組分別以銀杏多糖 200、100、50 mg·kg－1，1 次·d－1進(jìn)行灌胃;對照組(聯(lián)苯雙酯組)聯(lián)苯雙酯100 mg·kg－1進(jìn)行灌胃;空白組和模型組分別以生理鹽水灌胃，連續(xù)2周。第14周隔夜禁食12 h后，模型組、銀杏多糖高中低劑量組和對照組小鼠分別腹腔注射0.15%CCl4花生油溶液2ml/只，空白組腹腔注射等劑量花生油，24 h后摘眼球取血，取血前12h小鼠禁食不禁水。然后處死小鼠取肝臟稱其重量，0℃左右生理鹽水沖洗干凈殘留血液，制備肝組織勻漿待用。

2.4 組織學(xué)觀察

觀察肝臟的形態(tài)和顏色，甲醛溶液固定、常規(guī)HE染色，在光鏡下觀察肝組織切片的結(jié)構(gòu)等組織學(xué)形態(tài)變化。

2.5 生化指標(biāo)檢測

血清 ALT、AST 及肝臟 SOD、MDA、GSH-Px、NO、TNF-α測定方法均按試劑盒說明書進(jìn)行。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(珋x±s)表示，組間比較采用配對t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 肝組織學(xué)觀察

對照組小鼠肝臟顏色光澤鮮亮有彈性且呈紅褐色，光鏡下觀察可見肝小葉結(jié)構(gòu)輪廓清晰，細(xì)胞核大而圓，胞漿致密。模型組小鼠肝臟色澤黯淡，表面粗糙。肝小葉結(jié)構(gòu)模糊且紊亂，細(xì)胞體積增大，肝細(xì)胞成片壞死。銀杏多糖高、中、低劑量組和對照組形態(tài)要好于模型組，但仍然有壞死區(qū)域，且不連成片，多呈點狀，這表明銀杏多糖對肝損傷有一定保護(hù)作用。

3.2 銀杏多糖對CCl4小鼠生化指標(biāo)的影響

模型組小鼠中血清ALT、AST活性、MDA含量明顯大于對照組，提示造模成功。

表1、2顯示，與空白對組比較，模型組和銀杏多糖低中高劑量組小鼠血清中ALT、AST、MOD含量明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與模型組比較，銀杏多糖低、中、高劑量組能明顯降低小鼠血清中ALT、AST活性，并與濃度有很大的依賴性。正常情況下，AST、ALT是細(xì)胞內(nèi)酶，血清中含量很少，但當(dāng)該細(xì)胞損傷時，細(xì)胞膜通透性增加，酶從細(xì)胞內(nèi)釋放到細(xì)胞外，從而導(dǎo)致血清中酶的濃度增加，活性增加，MDA含量升高。實驗結(jié)果提示，銀杏多糖對CCl4導(dǎo)致的小鼠肝細(xì)胞損傷有一定的保護(hù)作用，模型組小鼠肝組織中SOD及GSH-Px活性水平顯著低于正常組(P＜0.01)。與模型組比較，銀杏多糖低中高劑量組小鼠肝組織中SOD和GSH-Px活性顯著增加(P＜0.01)。結(jié)果顯示，銀杏多糖能顯著抑制肝損傷小鼠肝組織中SOD和GSH-Px活性的降低，提示銀杏多糖有很強的抗氧化能力。

表1 銀杏多糖對肝損傷小鼠血清ALT、AST的影響(珔x±s，n=10)

3.3 銀杏多糖對肝損傷小鼠肝組織NO、TNF-α含量的影響

表3顯示，銀杏多糖可顯著降低肝損傷小鼠血清中NO、TNF-α的含量，與濃度有一定的依賴關(guān)系，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

表3 銀杏多糖對肝損傷小鼠肝組織中NO、TNF-α含量的影響(珔x±s，n=10)

4 討論

肝臟的一大特征就是含有豐富的酶類，代謝特別活躍，而這些代謝活動的主角是血竇中的血管內(nèi)皮細(xì)胞和星狀細(xì)胞。當(dāng)肝功能持續(xù)障礙一定時間后，星狀細(xì)胞的性質(zhì)就會發(fā)生改變并制造很多骨膠原，導(dǎo)致肝臟纖維化，同時星狀細(xì)胞還會制造平滑肌激動蛋白，收縮血竇。

四氯化碳可直接損害肝細(xì)胞引起一些特異變化。四氯化碳在肝臟可代謝生成CCl3自由基和Cl自由基，這2種自由基會破壞細(xì)胞膜上的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)大分子，引起代謝障礙，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，從而增強細(xì)胞膜的通透性，導(dǎo)致正常情況下位于細(xì)胞內(nèi)的酶外流，而ALT和AST主要存在于肝細(xì)胞中，所以這2種酶在一定程度上可以反映肝細(xì)胞的損傷程度。另外，MDA也是反映肝損傷程度的有效指標(biāo)，其含量越高說明肝細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化越強，受損越嚴(yán)重［10］。再者·CCl3自由基可以抑制細(xì)胞膜和微粒體膜的鈣泵活性，鈣離子內(nèi)流［11］從而導(dǎo)致胞內(nèi)鈣離子濃度增加。SOD、GSH-Px是體內(nèi)重要的抗氧化酶類，可以有效清除機體產(chǎn)生的自由基，減弱機體的氧化應(yīng)激狀態(tài)。該研究表明，不同劑量的銀杏多糖可以顯著降低小鼠血清中ALT、AST、MDA含量，并能提高SOD、GSH-Px活性，顯示銀杏多糖對四氯化碳引起的小鼠肝損傷有一定的保護(hù)作用，且與濃度直接相關(guān)。同時SOD、GSH-Px的活性升高和2種酶活性的升高保持一致關(guān)系，暗示銀杏多糖主要通過清除損傷小鼠體內(nèi)的自由基來對其進(jìn)行有效保護(hù)。

Kupffer細(xì)胞(KCs)是肝臟血竇內(nèi)的常駐細(xì)胞，肝臟是門靜脈血流匯入的器官，同時也會帶來抗原、細(xì)菌等。而KCs可以去除其中的抗原細(xì)菌等異物，同時也會引起炎癥反應(yīng)。受其他物質(zhì)的影響(如干擾素γ、白細(xì)胞介素-12(IL-2)，KCs會增生、活化，從而釋放出各種胞質(zhì)變動物質(zhì)和活性氧，引起肝臟障礙。TNF-α主要有肝臟kuffer細(xì)胞和肝實質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生，是肝臟疾病發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵因素。綜合研究數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，TNF-α的水平和肝臟病變的嚴(yán)重程度正相關(guān)，過高濃度的TNF-α可以誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡和壞死［12，13］。研究發(fā)現(xiàn)，抗氧化物質(zhì)的缺乏可以導(dǎo)致小鼠肝細(xì)胞對 TNF-α介導(dǎo)的肝損傷更加敏感［14］。TNF-α對血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生損害，導(dǎo)致其功能代謝紊亂，在肝實質(zhì)細(xì)胞和Kupffer細(xì)胞、肝內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)型NOS合酶的作用下產(chǎn)生NO，而誘導(dǎo)型NO會通過抑制肝細(xì)胞翻譯過程和損傷遺傳物質(zhì)DNA加重肝臟的受損程度，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。同時，NO本身作為一種自由基也會加重機體的氧化應(yīng)激狀態(tài)。該研究揭示，銀杏多糖可以有效降低四氯化碳導(dǎo)致的小鼠肝組織中NO、TNF-α的含量，對小鼠肝臟有一定的保護(hù)作用。

該研究發(fā)現(xiàn)，漯河地區(qū)銀杏葉中提取的銀杏多糖得率為4.15%，對四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷導(dǎo)致 ALT、AST、MDA、SOD、GSH-Px的含量增高可以有效抑制，同時能顯著降低肝損傷小鼠血清中NO、TNF-α的含量，提示銀杏多糖可能通過清除誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)自由基、提高抗氧化作用而對誘導(dǎo)小鼠起到保護(hù)作用。

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