易 韜
(四川大學華西第二醫(yī)院 婦科腫瘤生物治療實驗室,成都 610041)
MicroRNAs 家族是一類內(nèi)源性的非編碼小RNA 分子,大多數(shù)miRNA 來自于70~90個堿基大小的單鏈RNA 前體,經(jīng)過Dicer酶加工后產(chǎn)生成熟的19~25個小核苷酸[1-4],在基因表達的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用,參與多種細胞過程,包括信號轉(zhuǎn)導、器官發(fā)育、疾病發(fā)生、藥理和毒理作用等[5]。miRNAs擁有復雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò),一個miRNA 可以調(diào)控多個基因的表達,而多個miRNAs也可以組合來調(diào)控某個基因的表達。雖然已經(jīng)有大量針對miRNA 的研究,但是絕大部分miRNA 的生物學功能仍然有待研究。
miR-30家族是由6個位于人類1,6,和8染色體上的基因編碼,包括5 個成員,miR-30a、miR-30b、miR-30c、miR-30d、miR-30e,它們之間的序列同源性非常高。microRNA 5’端2-8個核苷酸被稱為種子序列(seed sequence),是靶標結(jié)合最關(guān)鍵的位點[6]。種子序列與mRNA 轉(zhuǎn)錄目標之間的互補性和mRNA 位點的二級結(jié)構(gòu)是靶向識別的關(guān)鍵因素[7-8]。由于miR-30家族的microRNA 的核苷酸種子序列有較高的保守性和重疊的表達模式,提示miR-30家族在生物功能上可能發(fā)揮關(guān)鍵作用(圖1)[9]。已查明miR-30的家族成員與成骨細胞分化,脂肪細胞分化,上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT),細胞衰老,心肌基質(zhì)重構(gòu)和腫瘤相關(guān)。
圖1 miR-30家族microRNA的核苷酸種子序列的保守性
上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition)簡稱EMT,是指上皮細胞失去上皮細胞的特征獲得典型的間充質(zhì)細胞特性的變化的生物學過程[10-11](圖2)。EMT 在疾病的發(fā)病機制過程中通過促進細胞發(fā)育和運動來促使新組織類型的產(chǎn)生,其主要的特征有細胞黏附分子減少、細胞角蛋白細胞骨架轉(zhuǎn)化為波形蛋白等,在胚胎發(fā)育、慢性炎癥、組織重建、癌癥轉(zhuǎn)移和多種纖維化疾病中發(fā)揮重要作用[12-15]。EMT 包括三種類型。I型EMT 是原始上皮細胞的過渡到能動間充質(zhì)細胞與胚胎形成過程中的細胞類型多樣化及器官形成相關(guān)。Ⅰ型EMT 既不引起纖維化也不誘導侵襲發(fā)生,并且在許多情況下,所產(chǎn)生的間充質(zhì)細胞經(jīng)歷MET 后引致次級上皮細胞產(chǎn)生。Ⅱ型EMT 涉及次級上皮細胞向成纖維細胞轉(zhuǎn)變,與傷口愈合,組織再生和器官纖維化相關(guān)[16]。Ⅲ型EMT 發(fā)生在已經(jīng)形成的實體瘤和與轉(zhuǎn)移性腫瘤上,是一種與上皮細胞惡性腫瘤相關(guān)的表型轉(zhuǎn)化[17]。原發(fā)性上皮組織腫瘤細胞通過Ⅲ型EMT 形成具有遷移能力的間充質(zhì)細胞,隨血流轉(zhuǎn)移至不同部位,形成腫瘤轉(zhuǎn)移灶。EMT 的啟動依賴許多不同的分子過程包括轉(zhuǎn)錄因子的激活,特異性細胞表面蛋白的表達,重組細胞骨架蛋白的表達,ECM 降解酶的產(chǎn)生,以及特定微小RNA 的表達[18]。
圖2 上皮細胞在miR-30家族作用下發(fā)生間充質(zhì)轉(zhuǎn)化
許多上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)的基因被預(yù)測為miR-30的靶點。研究發(fā)現(xiàn),miR-30家族水平與人胚胎胰腺上皮細胞間充質(zhì)表型轉(zhuǎn)化相關(guān)[18]。另一方面,在胰島間充質(zhì)細胞去分化向產(chǎn)生激素的胰島樣細胞團塊發(fā)展過程中miR-30家族的miRNA水平提高。根據(jù)這些研究結(jié)果,使用anti-miRNA去除miR-30導致上皮細胞發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)表型轉(zhuǎn)化,而miR-30異位過表達的組織維持上皮細胞表型。此外,研究者發(fā)現(xiàn),miR-30家族的miRNA 靶向間充質(zhì)的波形蛋白的mRNA 并抑制其翻譯[19]。
在心肌肥大過程中miR-30和miR-133對纖維化的作用可以通過下調(diào)來影響其靶向的系列ECM mRNA,包括膠原,原纖維蛋白和彈性蛋白mRNA。miR-30靶向轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β)的下游促纖維化的分子-結(jié)締組織生長因子在心肌的細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)變化中起重要作用[20]。在腎臟內(nèi)環(huán)境研究中,滲透調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子NFAT5(TonEBP)有三個保守的miR-30的結(jié)合位點[21]。同樣,大量的溶質(zhì)載體(SLC)的蛋白質(zhì)中的mRNA 在它們的3'UTR 端有miR-30的結(jié)合位點[22]。通過敲 除miR-30A-5P 確定轉(zhuǎn)錄因子Xlim1/Lhx1是miR-30的重要靶標,這個轉(zhuǎn)錄因子在老鼠和青蛙腎發(fā)育中必需[23]。
miR-30是由致癌信號如表皮生長因子(EGF)和肝細胞生長因子下調(diào),在前列腺癌標本中低表達。這些基因中的ETS相關(guān)基因(ERG)是最常見的癌基因。miR-30在前列腺癌細胞中過度表達抑制EMT 表型從而抑制細胞遷移和侵襲。它也能在體外體內(nèi)抑制依賴于TMPRSS2-ERG 增殖的VCAP細胞的生長[24]。在HT-29 細胞系的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化microRNA 表達研究中發(fā)現(xiàn),HT-29經(jīng)過TGF-β處理后建立EMT 模型,通過實時定量PCR分析,miR-30水平明顯下調(diào)[25]。
miR-30也參與肝細胞的EMT 過程。研究發(fā)現(xiàn),TGF-β1 誘導的EMT 過程在AML12小鼠肝細胞中當鋅指轉(zhuǎn)錄因子SNAIL1的表達增加時,miR-30的表達顯著下調(diào)。通過計算microRNA 靶標預(yù)測到SNAIL1 的mRNA 的3′UTR 區(qū)域有一個與miR-30保守序列匹配的位點。研究結(jié)果證實miR–30通過與SNAIL1的預(yù)測位點結(jié)合產(chǎn)生負反應(yīng)調(diào)節(jié)。更重要的是,通過細胞形態(tài)的變化和SNAIL1的表達譜,E-cadherin和其他纖維母細胞標記物評估發(fā)現(xiàn)用miR-30b的化學合成物轉(zhuǎn)染細胞能顯著抑制TGF-β1誘導的EMT 過程[26]。
在對甲狀腺癌研究中發(fā)現(xiàn)miR-200和miR-30的下降可明確區(qū)分乳頭和濾泡來源的甲狀腺癌。ATC來源的間充質(zhì)細胞中這些microRNA 的表達通過調(diào)節(jié)MET 標志物蛋白的表達減少其入侵和誘導間充質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化(MET)。ATC 源性細胞miR-30和/或miR-200成員控 制Smad2 和TGFBR1 的 表達的上調(diào)從而調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β 信號在MET/EMT 中的作用[27]。
研究者對4419例人體樣本(3312例癌癥,1107例良性腫瘤)microRNA(miRNA)進行了詳細分析,研究了miRNA 表達譜,其中包括50種正常組織和51 種癌癥組織。良性腫瘤和癌癥microRNA 網(wǎng)絡(luò)顯示MIR-30處于網(wǎng)絡(luò)中心作用最為突出[28](圖3)。
圖3 miR-30處于miRcroRNA網(wǎng)絡(luò)中心調(diào)控位置摘自Genome Res,2010,20(5):589-99
最近的研究顯示miR-30的表達與腫瘤之間關(guān)系密切,miR-30被認為是乳腺癌,膀胱癌,結(jié)腸癌和肺癌轉(zhuǎn)移的標志[29]。事實上miR-30c的表達已被建議作為內(nèi)分泌治療雌激素受體陽性乳腺癌的預(yù)測因子[30]。miR-30家族成員在雌激素受體和孕激素受體陰性的腫瘤都是下調(diào),這表明miR-30的表達是通過這些激素調(diào)節(jié)[31]。miR-30家族調(diào)節(jié)乳腺癌細胞在非粘附條件下生長。研究發(fā)現(xiàn)非粘附條件下生長的親代乳腺癌細胞miRNA表達中miR-30 低表達。進一步的研究表明主要是miR-30a通過調(diào)節(jié)凋亡和增殖相關(guān)基因的表達來控制腫瘤細胞非粘附性生長。抗凋亡蛋白AVEN能部分逆轉(zhuǎn)miR-30a過表達的影響。而miR-30a的體內(nèi)的過表達可以降低乳腺腫瘤的發(fā)展趨勢[32]。
DLL4屬于Notch 信號家族膜結(jié)合配體,在腫瘤血管發(fā)生和發(fā)展過程中起基礎(chǔ)性作用[33-34]。在血管生成的體外模型中,miR-30b在內(nèi)皮細胞中過表達導致新生血管數(shù)量和長度增加。在斑馬魚胚胎顯微注射miR-30b化學合成物造成DLL4抑制導致節(jié)間血管過度萌發(fā)和背主動脈直徑的減少。對DLL43′-UTR端使用靶點保護拮抗miR-30結(jié)合導致DLL4上調(diào),與VEGFA信號通路敲除協(xié)同作用可抑制新生血管生成[35]。另有研究報道m(xù)iR-30a的表達通過刺激頂端細胞導致節(jié)間動脈的分支增加。在體外和體內(nèi)實驗中發(fā)現(xiàn)miR-30a直接靶向Notch配體Dll4。在人類內(nèi)皮細胞中,miR-30a下調(diào)將增加DLL4蛋白質(zhì)水平激活Notch信號通路導致HEY2和EFNB2(和ephrin-B2)的表達。miR-30b可以通過靶向DLL4調(diào)節(jié)血管生成[36]。
研究表明,在TRAIL-耐受的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞中,miR-30b/c和miR-21水平升高,這些miRcroRNA通過抑制功能蛋白的表達來抑制TRAIL依賴性凋亡的發(fā)生。用miR-21或miR-30b/c處理T98G敏感細胞誘導產(chǎn)生TRAIL耐受。此外,miR-30b/c和miR-21的分別靶向caspase-3和TAp63的mRNA,而這些蛋白質(zhì)在在人成膠質(zhì)細胞瘤原代細胞和肺癌細胞TRAIL耐受過程中發(fā)揮作用[37]。
細胞衰老是不可逆轉(zhuǎn)的生長過程和主要的抑癌機制。miR-29和miR-30的microRNA家族在誘導細胞衰老過程中上調(diào)并激活Rb的途徑。miR-29和miR-30和結(jié)合B-Myb蛋白3'UTR位點導致BMyb蛋白基因表達被抑制從而導致細胞衰老。在增殖期細胞中,miR-29和miR-30阻遏野生型BMyb蛋白3'UTR,抑制細胞DNA的合成。miR-29和miR-30通過結(jié)合到B-Myb蛋白3'UTR結(jié)構(gòu)域激活Rb的途徑在細胞衰老中起重要調(diào)節(jié)作用[38]。
LIN28是一種進化上保守的RNA結(jié)合蛋白在腫瘤發(fā)生和胚胎干細胞的分化中起重要作用。let-7,miR-125,miR-9,和miR-30與LIN28的表達水平呈負相關(guān)。LIN28-陽性的腫瘤細胞與LIN28-陰性的腫瘤細胞相比較,這四個miRNA的表達水平顯著降低。研究表明在胚胎干細胞和癌細胞中這四個miRRNA 能直接抑制LIN28表達[39]。
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