羅雙靈 孫維佳

·綜述與講座·

急性胰腺炎中的損傷相關(guān)分子模式

羅雙靈 孫維佳

急性胰腺炎 (acute pancreatitis, AP)是多種病因引起胰酶激活，以胰腺局部炎癥反應(yīng)為主要特征， 伴或不伴有其他器官功能改變的疾病[1]。其初始階段的局部炎癥反應(yīng)已被證實了是由胰腺腺泡細胞的損傷及壞死介導的[2]。細胞損傷后釋放的物質(zhì)被稱為損傷相關(guān)分子模式(Damage associated molecular pattern, DAMPs)。近年來越來越多的證據(jù)證明壞死的胰腺腺泡細胞釋放的DAMPs介導的炎癥反應(yīng)是決定胰腺損傷及疾病嚴重程度的關(guān)鍵因素[3]。本文就急性胰腺炎中的DAMPs作一綜述。

一、DAMPs及受體

機體免疫系統(tǒng)分為固有免疫系統(tǒng)及獲得性免疫系統(tǒng)。獲得性免疫是由機體后天形成，通過B淋巴細胞及T淋巴細胞高度特異性識別病原體表面分子來清除病原體。固有免疫由巨噬細胞、樹突狀細胞、中性粒細胞及肥大細胞等通過細胞表面的模式識別受體(pattern-recognition receptor， PRRs)識別一些病原體共有的結(jié)構(gòu)域，即病原相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular pattern，PAMP)來實施對病原體的清除[4]。近年來已經(jīng)證實了免疫細胞表面的PRRs也可以被自身分子模式所激活，這些自身分子模式一般存在于細胞內(nèi)，在健康機體中不會引起免疫反應(yīng)。當機體受到創(chuàng)傷、炎癥等應(yīng)激狀況影響時，這些自身分子模式會由損傷的細胞釋放至血液中激活相應(yīng)的PRRs而引起相應(yīng)的炎癥反應(yīng)，因此這些自身分子被稱為損傷相關(guān)分子模式[5]。目前已知的DAMPs有高遷移率族蛋白1(high mobility group box 1 protein，HMGB1)、熱休克蛋白(heat-shock proteins, HSPs)、透明質(zhì)酸、S100蛋白、C3a、C4a、基因組DNA、RNA、尿酸、硫酸肝素及ATP等[6]。與這些DAMPs相對應(yīng)的受體有Toll樣受體(Toll-like receptors, TLRs)、晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation end products，RAGE)、P2X7受體、Nod樣受體(Nod-like receptors, NLRs)等[7-9]。DAMPs與受體結(jié)合后可激活MAPKs、NF-κB及PI3K/AKT等信號通路，從而可引起炎癥反應(yīng)或調(diào)節(jié)細胞死亡。目前發(fā)現(xiàn)在敗血癥、關(guān)節(jié)炎、動脈粥樣硬化、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、克羅恩病及癌癥中都存在外周血DAMPs水平的升高[10]。

在炎癥反應(yīng)過程中， DAMPs與相應(yīng)的PRRs結(jié)合后引起炎性因子的釋放至少需要激活兩條信號通路。通路1是HGMB1、HSPs、S100及基因組DNA等DAMPs通過細胞膜或內(nèi)膜上的TLR4、TLR9、RAGE及TREM1受體誘發(fā)前炎性因子如前白介素1β(IL-1β)、前白介素18(IL-18)的產(chǎn)生。通路2是由ATP、尿酸、膽固醇結(jié)晶等DAMPs通過膜上的P2X7受體、Nod樣受體等激活一種稱為NLRP3炎性體(inflammasome)的胞質(zhì)復合物，這種炎性體由 Nod樣受體蛋白3(Nod-like receptor protein 3, NLRP3)、凋亡相關(guān)的斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD, ASC)及caspase-1組成[11]，可以調(diào)節(jié)半胱氨酸激酶1(caspase 1)的蛋白水解成熟，從而將前促炎因子如pro-IL-1β、pro-IL-18轉(zhuǎn)化為成熟的形式[3]。在這兩條信號通路中，NLRP3炎性體的活化是引起炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵因素，也是產(chǎn)生IL-1β的必要步驟。IL-1β異常增多的一些疾病大都與NLRP3炎性體的過度激活相關(guān)[12]。

二、DAMPs與急性胰腺炎

在AP病程進展過程中，炎性因子的過度激活及級聯(lián)放大效應(yīng)發(fā)揮了重要作用，炎性反應(yīng)的程度決定了疾病的嚴重程度及病死率[13]。目前研究發(fā)現(xiàn)許多DAMPs都參與了AP的炎癥放大過程，且發(fā)揮重要作用[3]。

1．HMGB1：HMGB1是一種重要的DAMP分子，它可以由壞死細胞被動釋放，也可以由巨噬細胞、NK細胞和成熟的樹突狀細胞主動分泌。HMGB1可刺激單核巨噬細胞、中性粒細胞、內(nèi)皮細胞等分泌IL-1β、TNF-α、IL-6等前炎癥因子，還能誘導血管內(nèi)皮細胞上內(nèi)皮細胞間黏附分子1(ICAM-1)、血管細胞間黏附分子1(VCAM-1)、E-選擇素的表達，進一步調(diào)節(jié)和放大炎癥反應(yīng)；還促進內(nèi)皮細胞釋放纖溶酶原激活物抑制因子-1(PAI-1)、組織型纖溶酶原激活物(t-PA)，打破生理的凝血和抗凝血平衡，在炎癥反應(yīng)時的組織缺血壞死、血栓形成、彌散性血管內(nèi)凝血的發(fā)生中發(fā)揮重要的作用[14]。HGMB1作用的受體較廣泛，如RAGE、TLR4、TREM1等，均可引起炎癥反應(yīng)[10]。Yasuda等[15]報道，重癥急性胰腺炎(SAP)患者外周血中HMGB1水平明顯高于健康對照組，且與患者入院時的嚴重度評分(Glasgow評分及日本嚴重度評分)、總膽紅素、LDH及CRP呈正相關(guān)，但與患者性別、病因、胰腺壞死程度、Ranson評分、APACHEⅡ評分及淀粉酶水平無關(guān)，有器官功能障礙的患者HMGB1水平高于無器官功能障礙的患者，病死組高于存活組，表明HMGB1在SAP病程進展中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，可作為早期預(yù)測AP病情進展及預(yù)后的重要指標。Kocsis等[16]比較了SAP與敗血癥患者外周血HMGB1水平，發(fā)現(xiàn)SAP患者HMGB1水平高于敗血癥患者，在感染性壞死性胰腺炎中表達水平最高，且與降鈣素原(PCT)水平呈正相關(guān)。但是作者在研究中同時發(fā)現(xiàn)，作為HMGB1主要受體RAGE的游離成分sRAGE的水平在SAP中與HMGB1呈負相關(guān)，而在敗血癥中則呈正相關(guān)，其原因不明，推測可能與減弱炎性循環(huán)中的反饋機制從而進一步加重AP中的炎癥反應(yīng)有關(guān)。在壞死性胰腺炎的動物模型中，HMGB1在外周血及受累及的器官(胰腺、肝臟、肺、腎、回腸)中表達均升高，且與遠處器官受累程度呈正相關(guān)[17]。Luan等[18]在鼠的SAP模型中發(fā)現(xiàn)HMGB1參與了腸黏膜屏障受損過程，回腸黏膜組織上HMGB1表達在發(fā)病6 h開始升高，持續(xù)48 h以上，且與腸黏膜炎癥浸潤程度呈正相關(guān)。用丙酮酸乙酯抑制HMGB1的表達可以明顯降低腸黏膜炎癥的程度。Sawa等[19]也在急性壞死性胰腺炎動物模型中發(fā)現(xiàn)利用HMGB1的中和抗體可以減輕SAP嚴重程度及器官損傷，但是會增加腸道細菌易位及感染的風險。以上研究表明HMGB1可能更多地參與了SAP的炎癥放大及后期的器官損傷,早期拮抗或中和HMGB1可能成為減輕SAP嚴重程度及改善患者病死率的有效治療手段之一。

2．DNA：血液循環(huán)中的DNA在許多疾病中被用來作為無創(chuàng)性的診斷工具之一，如自身免疫性疾病、腫瘤、產(chǎn)前診斷等。然而近年來研究發(fā)現(xiàn)宿主細胞受損后釋放的雙鏈DNA片段也可以作為一種損傷相關(guān)分子模式，通過免疫激活TLR9而促進組織損傷。Oka等[20]在2012年4月份《自然》雜志上報道，動物實驗結(jié)果顯示由于高血壓等原因使心肌細胞內(nèi)的線粒體受損后，導致無用的線粒體DNA蓄積，這會引發(fā)“過度”的免疫反應(yīng)，受損的線粒體DNA蓄積后，蛋白質(zhì)“TLR9”會發(fā)揮作用，激活免疫反應(yīng)，引發(fā)心肌炎癥，嚴重者可導致心力衰竭。進一步研究發(fā)現(xiàn)，即使能分解線粒體DNA的酶無法發(fā)揮作用，只要投放能遏制“TLR9”的物質(zhì)，那么小鼠即使出現(xiàn)高血壓等情況，也不會出現(xiàn)心肌炎引發(fā)的心力衰竭。另一項發(fā)表在Shock雜志上的研究表明，創(chuàng)傷性休克鼠血液中釋放的大量線粒體DNA激活Toll樣受體9，引起細胞因子釋放，可能是創(chuàng)傷引起全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)的反應(yīng)機制之一[21]。Walker等[22]也證實，給小鼠注射脂質(zhì)體/DNA可通過激活Toll樣受體9而誘發(fā)SIRS。以上研究都表明損傷后所釋放的DNA可引起炎癥反應(yīng)。Kocsis等[16]在SAP患者血清中發(fā)現(xiàn)DNA水平明顯升高，且與患者CT評分呈正相關(guān)，輕癥組及正常對照組之間無明顯差別。 Gornik等[23]用實時PCR法檢測30名AP患者入院后第1、4、7天外周血DNA水平，發(fā)現(xiàn)SAP患者入院后第1、4天血清DNA水平明顯高于輕癥患者，當入院第一天血清DNA≥0.118 ng/μL時，其對于AP嚴重程度的預(yù)測敏感性為100%，特異性為89.5%，ROC曲線下面積為0.97，陽性預(yù)測值為83.3%，陰性預(yù)測值為100%，甚至優(yōu)于Ranson評分(≥3)、APACHE II評分(≥9)及CRP(≥97)，且血清DNA水平與胰腺壞死程度呈正相關(guān)，因此認為血清DNA可以作為早期預(yù)測AP嚴重程度的重要指標。 但Bagul等[24]卻得出相反的結(jié)果，SAP患者血清DNA水平較對照組明顯下降，且與胰腺壞死程度無相關(guān)性。幾項研究結(jié)果不一致可能的原因有：(1)檢測時間不一致，Bagul等檢測的時間相對較晚(平均為5 d)，DNA可能存在降解或被吞噬，而前兩者檢測時間較早(≤2 d)；(2)檢測對象不一致，Bagul等檢測對象為入院48 h內(nèi)APACHEⅡ評分>8分的SAP患者，Gornik檢測的是所有入院的AP患者；(3)實驗方法，包括標本的處理、DNA提取及檢測方法，三項研究都不一致。所以AP患者外周血DNA水平與AP嚴重程度的相關(guān)性還需大樣本實驗研究。最近Hoque等[25]在AP小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，建模后1 h外周血DNA水平即明顯升高，基因敲除DNA特異性受體TLR9及加入TLR9拮抗劑都可以明顯減輕AP的胰腺水腫、炎癥及壞死程度，認為TLR9拮抗劑對于AP具有潛在的治療效果。這些研究結(jié)果提示，DNA及受體TLR9是AP發(fā)病過程中炎癥反應(yīng)的重要組成成分，尤其對于急性壞死性胰腺炎。AP發(fā)病早期外周血游離DNA水平可有效預(yù)測疾病的嚴重程度，可以作為早期檢測指標之一。

3．熱休克蛋白(HSPs)：HSPs是機體在受到環(huán)境中物理、化學、生物、精神等刺激時，尤其是在高溫狀態(tài)時釋放的一類高度保守的蛋白質(zhì)，普遍存在于所有細菌、植物及哺乳動物的細胞。HSPs主要作為一種分子伴侶，參與新合成蛋白的折疊、蛋白質(zhì)的細胞內(nèi)變形和易位、蛋白質(zhì)的復性及清除嚴重受損的蛋白質(zhì)，從而發(fā)揮細胞保護功能。在AP中，胰腺細胞也會產(chǎn)生大量的熱休克蛋白，如HSP72[26]、HSP27[27]、HSP70[28]，發(fā)揮對胰腺腺泡細胞的保護作用。然而最近的研究發(fā)現(xiàn)、細胞內(nèi)的HSP70釋放至細胞外環(huán)境后可以作為一種DAMP，激活免疫反應(yīng)而促進炎癥因子釋放。Song等[29]研究發(fā)現(xiàn)，外源性給予AP鼠Hsp 70可加重AP的嚴重程度及胰腺外并發(fā)癥，如SIRS、胰源性肺損傷，而基因敲除TLR4后，外源性的HSP70則無此作用，提示外源性HSP70通過TLR4而引起SIRS反應(yīng)，從而增加了胰腺及遠處器官的損傷。除了HSP70，目前尚無其他熱休克蛋白作為DAMPs的報道。

4．ATP、尿酸、膽固醇結(jié)晶等小分子：這些小分子物質(zhì)可以由壞死的細胞釋放，也可以由機體本身血液循環(huán)中產(chǎn)生，它們的共同特點是都會通過各自的通路激活NLRP3炎性體。NLRP3炎性體已被證實在非感染性炎性疾病中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[12]。Hoque等[25]證實，NLRP3炎性體的三種成分NLRP3、ASC及Caspase 1均參與AP的損傷過程，敲除ATP分子的受體P2X7后可減輕AP的胰腺損傷及炎性反應(yīng)。Duewell等[30]也證實Caspase 1是胰腺炎腺泡細胞死亡及炎性網(wǎng)絡(luò)中必需的成分，將其基因敲除后可明顯減輕這些反應(yīng)。NLRP3炎性體所介導的效應(yīng)在AP中主要是促進IL-1β及IL-18的釋放。IL-1β所介導的信號通路在動物實驗中被證明是AP損傷及遠處器官損傷所必須的[31-32]。有證據(jù)表明，IL-1β在胰腺炎損傷早期的無菌性炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用。血清中IL-1β水平在AP發(fā)病24 h內(nèi)迅速升高，且SAP患者的水平明顯高于MAP患者[33]。這些結(jié)果在動物模型中也得到了證實，胰腺內(nèi)的IL-1β水平超過了血清中的水平，且血清中IL-1β高峰早于IL-6的高峰[34]。給予外源性IL-12，可在野生型鼠中誘導出急性水腫性胰腺炎模型，在肥胖鼠中可誘導出壞死性胰腺炎模型[35-36]。另有研究報道，IL-18似乎在胰腺炎過程中發(fā)揮了一定的保護作用，敲除IL-18基因后可導致更嚴重的胰腺損傷[37]。AP患者血清IL-18的水平與疾病嚴重程度相關(guān)，且腹水IL-18的濃度比血清水平高20倍[38-40]。以上研究結(jié)果表明DAMPs所介導的炎癥反應(yīng)貫穿于AP整個發(fā)病過程。

三、總結(jié)

AP發(fā)病機制非常復雜，其中炎癥反應(yīng)由局部擴散至全身引起全身炎癥反應(yīng)綜合征是決定疾病嚴重程度及病死率的關(guān)鍵因素。以往我們常常強調(diào)炎性細胞及炎性因子在參與AP發(fā)病過程中的重要性，而忽略了引起這些炎性反應(yīng)的刺激因素，如細胞受損后釋放的各種DAMPs，它們的持續(xù)存在是引起炎性反應(yīng)放大及遠處器官損傷的重要原因。在正常機體中，細胞損傷后釋放的DAMPs會因氧化還原反應(yīng)或吞噬反應(yīng)而被清除，因而不會引起持續(xù)的炎性反應(yīng)。而在AP中，由于存在氧化還原反應(yīng)及吞噬功能的減弱，引起DAMPs持續(xù)累積，從而刺激炎性細胞釋放過多的炎性因子，其中的具體機制尚不清楚。從上述的研究中可以發(fā)現(xiàn)一些DAMPs在AP早期即可以很好地預(yù)測疾病的嚴重程度，將來有可能可作為臨床重要的檢測指標。

鑒于DAMPs在AP炎癥放大過程中發(fā)揮的重要作用，而且在實驗中應(yīng)用DAMPs拮抗劑或基因敲除DAMPs受體可以明顯減輕AP的炎癥反應(yīng)程度。所以我們有理由相信關(guān)于AP中DAMPs的研究將為臨床上治療AP提供新的思路及策略。

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2012-10-31)

(本文編輯：屠振興)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2013.04.023

410008 湖南長沙，中南大學湘雅醫(yī)院普通外科

孫維佳，Email:sunweijia6@126.com