徐清 滿曉華 高軍 李兆申 龔燕芳 吳紅玉 金晶

·論著·

人胰腺癌編碼SUFU蛋白的新剪接體

徐清 滿曉華 高軍 李兆申 龔燕芳 吳紅玉 金晶

目的分析人胰腺癌組織和細胞中Hedgehog信號通路主要成員SUFU蛋白的剪接體。方法用反轉(zhuǎn)錄和3′cDNA末端快速擴增(3′RACE)法擴增suppresser of fused(SUFU)片段，測序發(fā)現(xiàn)一個新的外顯子，應用RT-PCR方法擴增全長含新外顯子的SUFU(nSUFU)。采用脂質(zhì)體法將nSUFU及SUFU轉(zhuǎn)染SW1990細胞，應用蛋白質(zhì)印跡法檢測SW1990細胞及胰腺癌組織新剪接體編碼的蛋白質(zhì)的表達。結(jié)果通過3′RACE法的第二輪巢式PCR擴增產(chǎn)物約600 bp，經(jīng)測序并將其序列與NCBI網(wǎng)站Blast序列對比分析發(fā)現(xiàn)，在SUFU mRNA isoform1(NM_016169.3)的第10外顯子和第11外顯子之間插入了一個長為126 bp的新外顯子。通過對SW1990細胞的驗證，包含新外顯子的完整的新剪接體片段長約1400 bp。轉(zhuǎn)染nSUFU的SW1990細胞強表達nSUFU蛋白，胰腺癌組織既表達SUFU蛋白，又表達nSUFU 蛋白。結(jié)論人類胰腺癌組織和細胞中存在一種新的可以編碼SUFU蛋白的剪接體。

胰腺腫瘤； Hedgehog信號通路； 剪接體； SUFU

Hedgehog信號通路的激活是胰腺癌的核心致病機制之一。脊椎動物中Hedgehog信號通路包括配體hedgehog，靶細胞表面受體Ptch1、Smo和下游的核轉(zhuǎn)錄因子Gli等，其中suppresser of fused(SUFU)可以調(diào)節(jié)Gli的活性，是Hedgehog的關鍵負調(diào)控因子。然而，正常的Hedgehog通路中一些細節(jié)卻并不明確，而且腫瘤中Hedgehog信號通路各成員以及它們與其他分子的相互作用也會發(fā)生變化，因此，這些問題成為科學家們關注和研究的熱點。本研究在擴增SUFU mRNA的過程中發(fā)現(xiàn)了一種新的可以編碼蛋白的SUFU剪接體(nSUFU)，在NCBI以及ensmbl等網(wǎng)站上還沒有被公布過?，F(xiàn)報道如下。

材料與方法

一、材料

人胰腺癌細胞株SW1990由長海醫(yī)院消化內(nèi)科實驗室保存，RNA iso Plus購自TaKaRa公司，3′RACE core set試劑盒購自TaKaRa公司，pcDNA3.1mychisA(+)表達載體購自invitrogen公司，SUFU(NM_016169.3)表達載體購自復能基因公司，兔抗人SUFU一抗(產(chǎn)品分類號：NBP1-40515)購自美國Novus biologicals公司，內(nèi)參GAPDH一抗購自Abmart公司，HRP標記的羊抗兔IgG二抗購自Abmart公司，飛克級ECL化學發(fā)光檢測試劑盒購自Thermo公司，人胰腺癌組織來自長海醫(yī)院外科手術(shù)切除的標本。

二、方法

1．SW1990細胞總RNA抽提：細胞常規(guī)培養(yǎng)、傳代。取對數(shù)生長期細胞，經(jīng)胰酶消化、離心收集細胞，用PBS洗滌后，加入200 μl RNA iso Plus，立刻吹散溶解細胞，加入40 μl三氯甲烷，混合均勻，4℃ 12 000 r/min離心10 min。將上清轉(zhuǎn)移到另一個新管中，加入70 μl無水乙醇，-20℃沉淀RNA 30 min，4℃ 12 000 r/min離心10 min。吸除上清，用DEPC處理水配置的70%乙醇100 μl洗滌沉淀2次，4℃離心10 min，吸除上清后開蓋室溫放置5 min使乙醇揮發(fā)，加入適量DEPC處理水溶解RNA沉淀。

2．cDNA末端快速擴增法(3′ rapid amplification of cDNA ends, 3′RACE)：3′RACE core set試劑盒內(nèi)有可以結(jié)合成熟mRNA polyA序列的adaptor反轉(zhuǎn)錄引物、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、第一輪巢式PCR的反向引物(outer primer)和第二輪巢式PCR的反向引物(inner primer)。先行反轉(zhuǎn)錄。將1 μl帶有polyA序列的胰腺癌SW1990細胞的RNA(500 ng/μl)和1 μl adaptor置70℃變性10 min，然后加M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶0.25 μl、RNase Inhibitor 0.25 μl、5×M-MLV Buffer 2 μl、dNTP Mixture 1 μl、RNase Free dH2O 4.5 μl。以試劑盒自帶的HL60細胞總RNA作為對照。反應條件：42℃ 60 min，70℃ 15 min。然后行兩輪巢式PCR(圖1)。

第一輪巢式PCR反應的正向基因特異性引物1(gene specific primer 1，GSP1)序列自行設計，為5′-CGCAAAGACAGCCTGGAAAGTGAC-3′， 在NM_016169.3的第9外顯子中，第一個堿基的位置在第1218核苷酸處。反向引物outer primer為3′RACE試劑盒自帶。PCR反應體系：上述逆轉(zhuǎn)錄反應液3 μl，1×cDNA Dilution BufferⅡ 7 μl，GSP1(10 μmol/L)2 μl，outer primer 2 μl, 10×Ex Taq Buffer(含Mg2+)5 μl，Ex Taq 0.25 μl，dH2O 30.75 μl。以試劑盒自帶的3′RACE control outer primer替代GSP1作為對照。反應條件：94℃ 3 min，94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 5 min，25個循環(huán)，72℃延伸10 min。

圖1 3′RACE巢式PCR擴增SUFU 3′UTR示意圖

第二輪巢式PCR反應的正向GSP2序列為5′-TCCTGCATGGACGGCACTTTAC-3′，在NM_016169.3的第10外顯子中，第一個堿基的位置在第1357核苷酸處。反向引物inner primer為3′RACE試劑盒自帶。PCR反應體系：第一輪PCR產(chǎn)物1 μl，dNTP Mixture 8 μl，10×Ex Taq Buffer(加Mg2+)5 μl，Ex Taq 0.5 μl，GSP2(10 umol/L)2 μl，inner primer 2 μl，dH2O 31.5 μl。以試劑盒自帶的3′RACE control outer primer替代GSP2作為對照。反應條件：94℃ 3 min，94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 5 min，30個循環(huán)，72℃延伸10 min。第二次PCR擴增產(chǎn)物大小約為600 bp，送invitrogen公司測序，發(fā)現(xiàn)一個新外顯子。

3．新外顯子的驗證：抽取胰腺癌SW1990細胞總RNA，用SUFU開放讀碼框反向引物(序列為5′ -CTAGTGTAGCGGACTGTCGAACA-3′)以及M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再使用SUFU第1外顯子的正向引物(序列為5′-CTCCAGGTTACCGCTATCGTC-3′)和SUFU新外顯子的3′反向引物(序列為5′-TTCGGTCAACAGAATCAGGTTTC-3′)進行PCR擴增(圖2)，擴增產(chǎn)物1400 bp左右。

圖2 RT-PCR擴增完整的SUFU新剪接體示意圖

4．全基因SUFU合成以及表達載體的構(gòu)建：由上海翰宇生物公司合成含新外顯子的新SUFU(nSUFU)的全基因，合成時在nSUFU序列前加上保護堿基CG、BamHI酶切位點GGATCC和為了滿足kozac序列表達需要的堿基GGG，在nSUFU序列尾部去除終止密碼子TGA，加上Age Ⅰ酶切位點ACCGGT和保護堿基GCGC。通過Bam HI和Age Ⅰ雙酶切和DNA連接酶將nSUFU 插入pcDNA3.1mychisA(+)表達質(zhì)粒，表達的nSUFU蛋白融合有His標簽。

5．細胞轉(zhuǎn)染以及蛋白質(zhì)印跡法檢測：用6孔板常規(guī)培養(yǎng)SW1990細胞，待細胞生長到80%融合時，采用脂質(zhì)體法將nSUFU及SUFU表達質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染SW1990細胞。收集轉(zhuǎn)染后的胰腺癌細胞以及胰腺癌組織，制備細胞或組織勻漿，采用蛋白質(zhì)印跡法檢測細胞、組織的nSUFU及SUFU蛋白的表達。最后ECL化學發(fā)光、攝影獲得發(fā)光圖像。

結(jié) 果

一、SUFU新外顯子的分析及驗證

第二輪巢式PCR擴增產(chǎn)物約600 bp(圖3)。測序獲得的序列經(jīng)過與NCBI網(wǎng)站Blast序列對比分析發(fā)現(xiàn)，在SUFUmRNA isoform1(NM_016169.3)的第10外顯子和第11外顯子之間插入了一個長為126 bp的新外顯子，新外顯子的序列為AGACCT-CCGTCCTGTGAGCTCCCGAGCCGTCCTGTGTGCTCA-CCTTCCTGTGTGCACTCCTTCCTTGTTATCTCACACG-GTGGAAACTTTTGTTCTTGGCAGCTGACAATTCCCA-GGGGAAACCTG(圖4)。通過對SW1990細胞的驗證，包含新外顯子的nSUFU完整剪接體的片段長約1400 bp(圖5)。含新外顯子的nSUFU剪接體與文獻報道的SUFU剪接體的比較見圖6。

圖3 第二輪巢式PCR擴增產(chǎn)物的電泳圖

圖4 巢式PCR擴增產(chǎn)物的測序圖

圖5 完整的包含新外顯子的剪接體nSUFUA的電泳圖

第10外顯子之前各剪接體外顯子相同，箭頭所指的是新發(fā)現(xiàn)的外顯子，數(shù)字表示的是外顯子所在染色體上的堿基位置

圖6nSUFU與其他SUFU剪接體的比較

二、SW1990細胞及胰腺癌組織nSUFU蛋白的表達

SW1990細胞低表達SUFU蛋白，轉(zhuǎn)染SUFU的SW1990細胞SUFU蛋白表達上調(diào)，轉(zhuǎn)染nSUFU的SW1990細胞強表達nSUFU蛋白。胰腺癌組織既表達SUFU蛋白，也表達nSUFU 蛋白(圖7)。

圖7SW1990細胞(1)、轉(zhuǎn)染SUFU的SW1990細胞(2)、轉(zhuǎn)染nSUFU的SW11990細胞(3)及胰腺癌組織(4)的SUFU和nSUFU蛋白的表達

討 論

胰腺癌的發(fā)病機制與多種信號轉(zhuǎn)導通路的激活有關，這些信號的激活部分是某些分子的基因突變導致的，比如K-ras的突變[1-2]。Hedgehog信號通路的激活是胰腺癌發(fā)病的核心致病機制之一[3-4]，其他與胰腺癌發(fā)病相關的通路有EGFR[5-8]、Notch[9-10]、凋亡信號通路等。Hedgehog在胰腺癌中的作用包括Hedgehog配體以自分泌和旁分泌的方式激活胰腺上皮細胞的生長，促進胰腺間質(zhì)結(jié)締組織增生[11]，促進上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)從而導致遠處轉(zhuǎn)移[12]。然而，Hedgehog通路各主要分子成員的相互作用還有待深入研究。

Hedgehog通路的配體Shh、Ihh、Dhh與跨膜受體Ptch結(jié)合，解除了它對Smo的抑制，Smo通過作用于SUFU，從而釋放Gli家族轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)位到細胞核，激活Hedgehog靶基因。

本實驗室前期的研究結(jié)果顯示，Hedgehog主要負調(diào)控因子SUFU在人胰腺癌組織中表達明顯增加[13]，與Hedgehog信號通路在胰腺癌組織中被激活的觀點似乎有矛盾，因此繼續(xù)深入研究SUFU分子尤為重要。本研究發(fā)現(xiàn)了一個新的SUFU剪接體(nSUFU)，它包含了一個新的外顯子，并且此剪接體在人胰腺癌組織中可以編碼相應的新的SUFU蛋白。剪接體的多樣性是生物體實現(xiàn)功能多樣性的機制之一，不同剪接體編碼不同蛋白質(zhì)，從而發(fā)揮不同的功能。最新研究結(jié)果顯示，某些蛋白質(zhì)的錯誤剪接體會導致腫瘤的發(fā)生。本研究新發(fā)現(xiàn)的nSUFU蛋白到底在胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展中起到什么樣的作用，是否在Gli活性形式的轉(zhuǎn)換中發(fā)揮不同于其他剪接體的作用還有待進一步研究。

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Anovelspliceosomeencodingisoformofsuppresseroffusedinhumanpancreaticcancer

XUQing,MANXiao-hua,GAOJun,LIZhao-shen,GONGYan-fang,WUHong-yu,JINJing.

Departmentofgastroenterology,ChanghaiHospital,SecondmilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China

Correspondingauthor:GAOJun,Emai:gaojunaaa@gmail.com,LIZhao-shen,Email:zhsli@81890.net

ObjectiveTo investigate spliceosome of suppresser of fused(SUFU), a major member of hedgehog signaling pathway in human pancreatic cancer.MethodsSUFU fragment was amplified by using reverse transcription and 3′RACE. After sequencing, a new exon was discovered, and then nSUFU was amplified by RT-PCR. nSUFU and SUFU were transfected into SW1990 by liposomes, and then the expressions of SUFU protein encoded by new spliceosome in SW1990 cells and pancreatic cancer tissues were detected by Western blot.ResultsPCR products by 3′RACE were of 600 bp, after sequencing and comparison with Blast data of NCBI, it was detected that a new exon was inserted between SUFU mRNA isoform1 (NM_016169.3) exon 10 and exon 11. After verification with SW1990, it was noted the entire new spliceosome containing new exon was of 1400 bp. SW1990 with nSUFU transfection strongly expressed nSUFU protein, and pancreatic cancer tissues expressed both SUFU and nSUFU protein.ConclusionsA new spliceosome of SUFU, which can encode SUFU protein, is present in pancreatic cancer tissue and cell.

Pancreatic neoplasms; Hedgehog signaling pathway; Spliceosomes; SUFU

2013-01-11)

(本文編輯：屠振興)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2013.04.005

國家自然科學基金(30910103911，81272663)；上海市重點科技攻關項目(11441901800)；國家科技支撐計劃(2006BAI02A12)

200433 上海，第二軍醫(yī)大學長海醫(yī)院消化內(nèi)科

共同第一作者：滿曉華

高軍, Emai: gaojunaaa@gmail.com, 李兆申,Email:zhsli@81890.net