胡佳佳 吳紅玉 金晶 朱春平 李兆申 高軍 李淑德

·論著·

胰腺癌細(xì)胞株Hedgehog信號(hào)通路活化與K-ras基因突變的相關(guān)性研究

胡佳佳 吳紅玉 金晶 朱春平 李兆申 高軍 李淑德

目的探討胰腺癌細(xì)胞株中Hedgehog信號(hào)通路活化與K-ras基因突變的相關(guān)性。方法采用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)人胰腺癌細(xì)胞株SW1990、PaTu8988、CFPAC-1、PANC1、AsPC-1、Capanc-2、BxPC-3的K-ras基因突變狀況及Hedgehog信號(hào)通路主要成員Gli1、Smo mRNA的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果PANC1、CFPAC-1、AsPC-1、PaTu8988細(xì)胞為12密碼子突變型，SW1990細(xì)胞為13密碼子突變型，BxPC-3、Capanc-2細(xì)胞為純野生型。AsPC-1、CFPAC-1、PANC1、PaTu8988、SW1990、BxPC-3、Capanc-2的Gli1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為7.84±8.92、1.82±3.45、1.00±0.00、0.07±0.10、0.88±1.48、0.52±0.98、0.15±0.19；Smo mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為144.00±58.33、3.48±3.77、1.00±0.00、81.68±28.26、0.72±0.87、0.34±0.60、0.02±0.03。K-ras基因野生型胰腺癌細(xì)胞Gli1、Smo mRNA的表達(dá)水平均較突變型胰腺癌細(xì)胞株顯著降低，其中野生型BxPC-3細(xì)胞Gli1、Smo mRNA表達(dá)量顯著低于突變型AxPC-1細(xì)胞(P值均<0.05)。結(jié)論胰腺癌細(xì)胞株中Hedgehog信號(hào)通路活化與K-ras基因突變具有相關(guān)性。

胰腺腫瘤； K-ras； 點(diǎn)突變； Hedgehog信號(hào)通路； 轉(zhuǎn)錄因子

胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展是個(gè)多種基因共同參與的多步驟、多階段過(guò)程。該過(guò)程中參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡的多種基因發(fā)生異常改變，如原癌基因K-ras的點(diǎn)突變等，均與胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。此外，胰腺癌的發(fā)生亦與多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常相關(guān)，如EGFR信號(hào)通路、Hedgehog信號(hào)通路、Smad4/TGF-β信號(hào)通路、Notch信號(hào)通路等。近年來(lái)的研究證實(shí)，Hedgehog信號(hào)通路活化是胰腺癌干細(xì)胞生存的前提，被認(rèn)為是胰腺癌的核心致病機(jī)制之一[1-2]。本研究觀察人胰腺癌細(xì)胞株的K-ras基因突變情況及Hedgehog信號(hào)通路活化狀況，探討兩者在胰腺癌發(fā)生、發(fā)展中的相關(guān)性及相互作用。

材料和方法

一、K-ras基因突變檢測(cè)

人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC1、CFPAC-1、BxPC-3、 AsPC-1、 Capanc-2、 PaTu8988、SW1990均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞所，常規(guī)培養(yǎng)、傳代。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，應(yīng)用酚-氯仿法抽提胰腺癌細(xì)胞DNA，使用NanoDrop核酸微量測(cè)量?jī)x(ND1000型)測(cè)定DNA濃度，以焦碳酸二乙酯(DEPC)水調(diào)整濃度至50 ng/μl。K-ras基因上、下游引物，K-ras-FAM Tagman MGB探針，K-ras-VIC Tagman MGB探針均由美國(guó)AppliedBiosystems公司合成；肽核酸(PNA)由韓國(guó)Panagene公司合成。采用實(shí)時(shí)PCR法檢測(cè)K-ras基因突變。總K-ras基因檢測(cè)反應(yīng)體系：Master Mix 7.5 μl，引物1.5 μl，MGB探針1 μl，DEPC水2.5 μl，模板2.5 μl。K-ras基因第12、13密碼子檢測(cè)反應(yīng)體系：Master Mix 7.5 μl，引物1.5 μl，PNA2.5 μl，MGB探針1 μl，模板2.5 μl。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，分別檢測(cè)K-ras基因第12、13密碼子突變及總K-ras基因。PCR反應(yīng)條件：95℃ 10 min，95℃ 10 s、70℃ 10 s、55℃ 5 s、72℃ 32 s，50個(gè)循環(huán)。

二、Gli1、Smo mRNA表達(dá)檢測(cè)

應(yīng)用Trizol抽提胰腺癌細(xì)胞總RNA，使用NanoDrop核酸微量測(cè)量?jī)x(ND1000型)測(cè)定mRNA濃度。Gli1、Smo及內(nèi)參GAPDH Taqman探針、引物均由美國(guó)Invitrogen公司設(shè)計(jì)合成。應(yīng)用Takara公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成Gli1、Smo 的cDNA。PCR反應(yīng)條件：50℃ 2 min，95℃ 10 min，95℃ 15 s、60℃ 1 min，50個(gè)循環(huán)。通過(guò)PCR儀自帶軟件獲取ΔCt值，mRNA表達(dá)量用公式2-ΔΔCt計(jì)算。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、胰腺癌細(xì)胞株K-ras基因的突變狀態(tài)

PANC1、CFPAC-1、AsPC-1、PaTu8988細(xì)胞為12密碼子突變型，SW1990細(xì)胞為13密碼子突變型，BxPC-3、Capanc-2細(xì)胞為純野生型(圖1)。

圖1 7株胰腺癌細(xì)胞株K-ras基因的PCR擴(kuò)增曲線

二、 胰腺癌細(xì)胞株Gli1、Smo mRNA的表達(dá)

AsPC-1、CFPAC-1、PANC1、PaTu8988、SW1990、BxPC-3、Capanc-2的Gli1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為7.84±8.92、1.82±3.45、1.00±0.00、0.07±0.10、0.88±1.48、0.52±0.98、0.15±0.19；Smo mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為144.00±58.33、3.48±3.77、1.00±0.00、81.68±28.26、0.72±0.87、0.34±0.60、0.02±0.03，其中K-ras基因野生型細(xì)胞株BxPC-3的Gli1、Smo mRNA表達(dá)水平均顯著低于K-ras基因突變型細(xì)胞株AsPC-1(P值均<0.05)。

三、K-ras基因野生型與突變型細(xì)胞株Gli1、Smo mRNA的表達(dá)差異

K-ras基因野生型胰腺癌BxPC-3、Capanc-2細(xì)胞的Gli1、Smo mRNA的表達(dá)水平較突變型胰腺癌細(xì)胞株顯著降低(P值均<0.05，圖2)。其中野生型BxPC-3細(xì)胞的Gli1、Smo mRNA表達(dá)與突變型AsPC-1細(xì)胞的差異最顯著。

圖2K-ras基因野生型與突變型胰腺癌細(xì)胞株Gli1(上)、Smo mRNA(下)表達(dá)量的比較

討 論

Hedgehog信號(hào)通路以組織特異的方式控制細(xì)胞的增殖及分化，在胚胎的正常發(fā)育中發(fā)揮重要作用，在正常成熟胰腺中不表達(dá)或僅輕度表達(dá)[3]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，多種人類(lèi)惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與Hedgehog信號(hào)通路的異常調(diào)控密切相關(guān)，如基底細(xì)胞癌、小細(xì)胞肺癌、食管癌、前列腺癌、胰腺癌等[4-5]。Ji等[6]研究認(rèn)為，癌基因K-ras突變導(dǎo)致胰腺癌發(fā)生的機(jī)制部分是通過(guò)激活Hedgehog信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的。Xu等[7]認(rèn)為，Hedgehog信號(hào)通路配體Shh可以通過(guò)增強(qiáng)K-ras癌基因的活性誘導(dǎo)胰腺癌發(fā)生，降低腫瘤細(xì)胞對(duì)持續(xù)性激活的Ras信號(hào)通路的依賴(lài)性。Pasea di Magliano等[8]采用一種可特異性激活胰腺上皮細(xì)胞中Hedgehog信號(hào)通路的小鼠模型研究胰腺癌的發(fā)病機(jī)制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠生長(zhǎng)到成年后可形成胰腺未分化癌，激活Ras信號(hào)通路可進(jìn)一步導(dǎo)致廣泛性胰腺上皮內(nèi)瘤變并提高腫瘤致死性，提示特異性激活胰腺上皮細(xì)胞中Hedgehog信號(hào)通路可以誘導(dǎo)胰腺瘤變，Ras和Hedgehog信號(hào)通路共同參與胰腺導(dǎo)管腺癌的形成。此外，Morton等[9]研究發(fā)現(xiàn)，由K-ras和Hedgehog聯(lián)合誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞株在應(yīng)用Hedgehog信號(hào)通路拮抗劑后，盡管信號(hào)通路被抑制，而腫瘤細(xì)胞仍可繼續(xù)增殖。因此深入探討胰腺癌發(fā)生分子機(jī)制中的Hdgehog信號(hào)通路與其他信號(hào)通路之間的相互作用成為研究的熱點(diǎn)。本研究檢測(cè)了7株胰腺癌細(xì)胞株的K-ras基因突變狀況及Hedgehog信號(hào)通路主要成員Gli1、Smo mRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示K-ras基因野生型胰腺癌細(xì)胞株Gli1、Smo mRNA的表達(dá)水平較突變型胰腺癌細(xì)胞株顯著降低，其中野生型BxPC-3細(xì)胞的Gli1、Smo mRNA表達(dá)水平與突變型AsPC-1細(xì)胞的差異最顯著，提示Gli及Smo基因表達(dá)與K-ras基因突變?cè)谝认侔┌l(fā)生、發(fā)展過(guò)程中具有相關(guān)性。

[1] Hidalgo M. Pancreatic cancer. N Engl J Med, 2010, 362:1605-1617.

[2] Hidalgo M, Maitra A. The hedgehog pathway and pancreatic cancer. N Engl J Med, 2009, 361:2094-2096.

[3] Lau J, Kawahira H, Hebrok M. Hedgehog signaling in pancreas development and disease. Cell Mol Life Sci, 2006, 63:642-652.

[4] Kasper M, Regl G, Frischauf AM, et al. GLI transcription factors: mediators of oncogenic Hedgehog signaling. Eur J Cancer, 2006, 42:437-445.

[5] Stecca B, Ruiz i Altaba A. The therapeutic potential of modulators of the Hedgehog-Gli signaling pathway. J Biol, 2002, 1:9.

[6] Ji Z, Mei FC, Xie J, et al. Oncogenic KRAS activates hedgehog signaling pathway in pancreatic cancer cells. J Biol Chem, 2007, 282:14048-14055.

[7] Xu FG, Ma QY, Wang Z. Blockade of hedgehog signaling pathway as a therapeutic strategy for pancreatic cancer. Cancer Lett, 2009, 283:119-124.

[8] Pasca di Magliano M, Sekine S, Ermilov A, et al. Hedgehog/Ras interactions regulate early stages of pancreatic cancer. Genes Dev, 2006, 20:3161-3173.

[9] Morton JP, Mongeau ME, Klimstra DS, et al. Sonic hedgehog acts at multiple stages during pancreatic tumorigenesis. Proc Natl Acad Sci U S A, 2007, 104:5103-5108.

ThestudyonthecorrelationofactivationoftheHedgehogsignalingpathwayandK-rasgenemutationsinpancreaticcancercelllines

HUJia-jia,WUHong-yu,JINJing,ZHUChun-ping,LIZhao-shen,GAOJun,LIShu-de.

DepartmentofGastroenterology,ChanghaiHospital,SecondMilitaryUniversity,Shanghai200433,China

Correspondingauthor:LIShu-de,Email:lishude57@126.com;GAOJun,Email:gaojunaaa@gmail.com

ObjectiveTo investigate the correlation of K-ras gene mutations and activation of Hedgehog signaling pathway in pancreatic cancer cell lines.MethodsReal-time PCR was used to detect K-ras gene mutations at codon 12 and 13 in pancreatic cancer cell lines of SW1990, PaTu8988, CFPAC-1, PANC1, AsPC-1, Capanc-2, BxPC-3 and the mRNA expression of Gli1, Smo in these cell lines.ResultsThe K-ras mutation of PANC1, CFPAC-1, AsPC-1, PaTu8988 was at codon 12, while SW1990 was at codon 13, BxPC-3, Capanc-2 were wild type. The expressions of Gli1 mRNA of AsPC-1, CFPAC-1, PANC1, PaTu8988, SW1990, BxPC-3, Capanc-2 were 7.84±8.92, 1.82±3.45, 1.00±0.00, 0.07±0.10, 0.88±1.48, 0.52±0.98, 0.15±0.19, and the expressions of Smo mRNA were 144.00±58.33, 3.48±3.77, 1.00±0.00, 81.68±28.26, 0.72±0.87, 0.34±0.60, 0.02±0.03. Gli1, Smo mRNA expressions of cells with wild tpye K-ras were significantly lower than those with mutant type, and wild type BxPC-3′s Gli1, Smo mRNA expressions were significantly lower than that of mutant AxPC-1 (P<0.05).ConclusionsActivation of Hedgehog signaling pathway may be related to K-ras gene mutations.

Pancreatic neoplasms; K-ras; Point mutation; Hedgehog signaling pathway; Transcription factor

2013-06-03)

(本文編輯：屠振興)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2013.04.012

重大國(guó)際合作項(xiàng)目(30910103911)

200433 上海，第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院消化內(nèi)科

李淑德，Email：lishude57@126.com；高軍，Email：gaojunaaa@gmail.com