劉勝男，王佳慶，梅升輝，趙志剛

萬(wàn)古霉素(Vancomycin)是一種三環(huán)糖肽類抗生素，其藥效較強(qiáng)，臨床上主要用于革蘭陽(yáng)性菌，特別是敏感腸球菌和耐甲氧西林的葡萄球菌屬(MRSA)所致的嚴(yán)重感染，也可用于難辨梭狀芽胞桿菌等所致的系統(tǒng)感染和腸道感染。其主要的不良反應(yīng)為腎毒性和耳毒性，嚴(yán)重者可導(dǎo)致腎衰竭和聽(tīng)力喪失［1］。萬(wàn)古霉素治療窗較窄，因此，根據(jù)患者的臨床情況，實(shí)施個(gè)體化給藥顯得尤為重要。國(guó)外指南認(rèn)為［2］，檢測(cè)萬(wàn)古霉素血藥濃度是反映藥物有效性最準(zhǔn)確和最實(shí)用的方法，目前國(guó)內(nèi)外很多醫(yī)療機(jī)構(gòu)已經(jīng)開(kāi)展了該藥的治療藥物監(jiān)測(cè)(TDM)。本文通過(guò)查閱文獻(xiàn)［3-5］，結(jié)合自身?xiàng)l件，建立一種快速測(cè)定法，并對(duì)健康志愿者的藥動(dòng)學(xué)進(jìn)行研究，為臨床安全、合理用藥提供參考。

1 材料

1.1 儀器 日本島津Class-VP高效液相色譜儀，包括LC-10AT輸液泵和SPD-10A紫外檢測(cè)器，色譜工作站軟件;高速離心機(jī)SCILOGEX D2012;渦旋混合器MVS-1;電子天平(Mettler AE163);超低溫保存箱(型號(hào):MDFU32V);移液器 DRAGON MED。

1.2 試藥 注射用鹽酸萬(wàn)古霉素(批號(hào):10356018，規(guī)格 500 mg/瓶，Eli Lilly Japan K.K，Seishin Laboratories);萬(wàn)古霉素標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào):BCBD7944V:SIGMA);乙腈(色譜純，批號(hào):112189，F(xiàn)isher公司);磷酸 (分析純，批號(hào):20110602，北京化工廠);磷酸二氫鉀(分析純批號(hào)，10017692，北京化學(xué)試劑公司);空白血漿為健康志愿者提供，來(lái)自北京血液中心;超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 受試對(duì)象 選擇3名健康男性志愿者，經(jīng)心電圖、血壓、血尿常規(guī)及肝腎功能檢查均正常。受試者均了解所進(jìn)行試驗(yàn)的目的、方法和意義，并書面簽署知情同意書。本試驗(yàn)方案通過(guò)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院倫理委員會(huì)討論通過(guò)。

2.2 色譜條件 Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相:乙腈-磷酸二氫鉀緩沖溶液(30 mM，pH 3.2)=10∶90(v/v)，流速 1.0 mL/min，進(jìn)樣量 20 μL，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)236 nm，柱溫20℃。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液及沉淀劑的配制 精密稱取萬(wàn)古霉素標(biāo)準(zhǔn)品20.0 mg，置于5 mL容量瓶中，加入30 mM的磷酸二氫鉀緩沖液至刻度，定容搖勻，配制成4 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量，分別用30 mM的磷酸二氫鉀緩沖液稀釋至50、100、200、500、1 000、2 000 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，所有配制成的溶液置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 血清樣品的處理 取血漿180 μL，加入標(biāo)準(zhǔn)溶液 20 μL，搖勻，加入 10%高氯酸溶液 80 μL，渦旋1 min，12 000 r/min離心 10 min，取上清液20 μL進(jìn)樣檢測(cè)。由藥物峰面積帶入外標(biāo)峰面積的標(biāo)準(zhǔn)曲線求得萬(wàn)古霉素的濃度。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取空白血漿180 μL，依次加入“2.3”項(xiàng)下萬(wàn)古霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液20 μL，配制成相當(dāng)于血藥濃度為 5、10、20、50、100、200 μg/mL的血漿樣品，每一濃度為3樣本，按“2.4”項(xiàng)下方法操作。以外標(biāo)法定量，以萬(wàn)古霉素濃度(X)為橫坐標(biāo)，血漿中萬(wàn)古霉素峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行回歸運(yùn)算，求得直線回歸方程為Y=3 126.8 X+1 3238(r=0.9 982，權(quán)重系數(shù)=1/x2)。結(jié)果表明，萬(wàn)古霉素血藥濃度在5～200 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，定量下限為5 μg/mL。

2.6 專屬性試驗(yàn) 取志愿者空白血漿200 μL，按“2.4”項(xiàng)下方法操作(不加標(biāo)準(zhǔn)溶液)，進(jìn)樣20 μL，得色譜圖1A;取志愿者空白血漿 200 μL，按“2.4”項(xiàng)下方法操作(加標(biāo)準(zhǔn)溶液)，同法操作，得色譜圖1B;取健康志愿者注射給藥后的血漿樣品，同法操作，得色譜圖1C，結(jié)果萬(wàn)古霉素的保留時(shí)間為13.5 min，且空白血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾萬(wàn)古霉素的測(cè)定。

圖1 血漿中萬(wàn)古霉素色譜圖

2.7 相對(duì)回收率與精密度試驗(yàn) 制備含萬(wàn)古霉素濃度分別為5、201、160 μg/mL的血漿樣品各5份，按“2.2”項(xiàng)下操作，記錄萬(wàn)古霉素峰面積。另配含萬(wàn)古霉素濃度分別為5、20、160 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液 200 μL各5份，加入10%高氯酸溶液80 μL混勻，渦旋混合 1 min，取上清液 20 μL 進(jìn)樣，記錄萬(wàn)古霉素峰面積。以每一濃度2種處理方法的峰面積比值計(jì)算絕對(duì)回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 絕對(duì)回收率及精密度試驗(yàn)結(jié)果(±s)

表1 絕對(duì)回收率及精密度試驗(yàn)結(jié)果(±s)

理論值(μg/mL) 測(cè)得量(μg/mL) 日內(nèi)RSD(%) 日間RSD(%) 絕對(duì)回收率(%)10 8.7±0.69 3.57 4.50 79.77 50 53.6±0.76 0.97 0.90 69.76 160 172.02±7.03 0.46 4.10 71.34

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 本文考察了低、中、高(10、50、160 μg/mL)3種濃度的萬(wàn)古霉素血漿樣品處理后室溫放置10 h、-70℃冰箱冷凍8 d、反復(fù)凍融2次樣品的穩(wěn)定性。見(jiàn)表2。結(jié)果表明，萬(wàn)古霉素在室溫放置凍融狀態(tài)下穩(wěn)定。

表2 萬(wàn)古霉素穩(wěn)定性考察(n=5)

2.9 實(shí)際樣品測(cè)定與藥動(dòng)學(xué)研究 3名健康志愿者在1 h內(nèi)靜脈滴注萬(wàn)古霉素500 mg，分別于給藥前及靜脈滴注后 0.25、0.5、0.75、1、1.5、3、6、12 h時(shí)采集靜脈血約2 mL，置于肝素管中，3 500 r/min離心10 min，血漿于-20℃保存。并按上述方法進(jìn)行實(shí)際樣品的測(cè)定，并以當(dāng)日的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其濃度，同時(shí)配制低、中、高(10、50、160 μg/mL)3種濃度的QC樣品，每一濃度進(jìn)行5個(gè)樣本分析，以確定當(dāng)日結(jié)果的可靠性。應(yīng)用本法測(cè)定了3名健康志愿者靜脈滴注萬(wàn)古霉素500 mg后不同時(shí)刻的血藥濃度，平均藥-時(shí)曲線見(jiàn)圖2。

根據(jù)測(cè)定結(jié)果，利用藥動(dòng)學(xué)軟件Phoenix1.1計(jì)算萬(wàn)古霉素的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，結(jié)果Cmax為21.13 μg/mL，tmax為 0.95 h，t1/2為 11.55 h，AUC0-∞為 218.00 μg·h/mL。

圖2 健康志愿者靜脈滴注萬(wàn)古霉素500 mg后的平均藥-時(shí)曲線

3 討論

本試驗(yàn)采用乙腈-30 mM磷酸二氫鉀緩沖液(10∶90，v/v)為流動(dòng)相，在調(diào)整兩者比例時(shí)發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源性物質(zhì)的出峰時(shí)間約為3 min，乙腈比例增加時(shí)，目標(biāo)峰出峰時(shí)間提前，內(nèi)源性物質(zhì)干擾增強(qiáng)，減少乙腈比例，目標(biāo)物質(zhì)出峰受內(nèi)源性物質(zhì)干擾減少，但峰型較差，調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH至3.2，目標(biāo)峰拖尾現(xiàn)象明顯減少，色譜峰型有所改善。

本試驗(yàn)采用外標(biāo)法，由藥物峰面積帶入外標(biāo)峰面積的標(biāo)準(zhǔn)曲線求得萬(wàn)古霉素的血漿濃度。目前國(guó)內(nèi)相關(guān)文獻(xiàn)多用內(nèi)標(biāo)法［6-8］，如去甲萬(wàn)古霉素、維生素B、替硝唑等，由于這些內(nèi)標(biāo)多為臨床常用藥，如果待測(cè)患者同時(shí)服用萬(wàn)古霉素和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，內(nèi)標(biāo)物質(zhì)可能作為內(nèi)源性雜質(zhì)干擾檢測(cè)結(jié)果，因此不能準(zhǔn)確計(jì)算萬(wàn)古霉素的血藥濃度。雖然外標(biāo)法簡(jiǎn)便，但對(duì)儀器的重現(xiàn)性和操作條件的穩(wěn)定性要求較高，需定期進(jìn)行曲線校正。

萬(wàn)古霉素為水溶性物質(zhì)，其血漿樣品提取方法多采用蛋白沉淀法，文獻(xiàn)報(bào)道的沉淀劑有10%三氯醋酸溶液、30%硫酸鋅溶液、乙腈-異丙醇等，本試驗(yàn)曾根據(jù)以上文獻(xiàn)方法對(duì)血漿樣品進(jìn)行處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)外標(biāo)曲線線性均不太理想，分析原因可能為操作較繁瑣，沉淀劑用量較大。選擇10%高氯酸沉淀蛋白，加入量少，色譜中雜質(zhì)峰與目標(biāo)峰分離較好，線性曲線較為理想。另外，此法樣品處理簡(jiǎn)單，只需沉淀離心，可定量測(cè)定到1.7 μg/mL，此定量下限足以滿足受試者靜脈滴注500 mg萬(wàn)古霉素的藥動(dòng)學(xué)研究需要。

國(guó)外指南《萬(wàn)古霉素治療成人金黃色葡萄球菌感染的治療監(jiān)測(cè)實(shí)踐指南》認(rèn)為，金黃色葡萄球菌暴露于萬(wàn)古霉素谷濃度＜10 μg/mL時(shí)，可產(chǎn)生具有萬(wàn)古霉素中介金葡菌樣特點(diǎn)，因此，推薦其血藥濃度谷值應(yīng)保持＞10 μg/mL以避免發(fā)生耐藥;為改善臨床感染治療的預(yù)后，提高藥物的組織滲透能力，指南推薦萬(wàn)古霉素血藥濃度谷值應(yīng)維持在 15 ～20 μg/mL，本方法快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、靈敏，為臨床開(kāi)展萬(wàn)古霉素血藥濃度監(jiān)測(cè)提供了參考方法。

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