陳 志, 高如承, 胡 青, 李 鵬, 賴素蘭

(福建師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 福建 福州 350108)

波紋巴非蛤(Paphia undulata)是一種肉質(zhì)細嫩、口感鮮美、營養(yǎng)豐富的海產(chǎn)雙殼貝類。隸屬于軟體動物門(Mollusca), 瓣鰓綱(Lamellibranchia), 簾蛤目(Veneroida), 簾蛤科(Veneridae), 巴非蛤?qū)?Paphia),俗稱“花蚶”、“油蛤”。它是一種暖水性淺海底棲貝類, 大都生活于大潮時水深0.5～3.5 m的潮下帶淺海底部軟泥中, 最深可分布到10 m水深。它具有高蛋白質(zhì)、低脂肪的特點[1], 除了富含有多種氨基酸以外,還含有氨基多糖和?；撬? 易被腸道消化吸收, 食療藥用價值較高, 具有抗腫瘤、降低血糖和改善糖尿病癥狀等作用[2]。目前對波紋巴非蛤的研究涉及眾多領(lǐng)域, 包括形態(tài)學(xué)[3-4]、繁育生物學(xué)[5-6]、生理學(xué)[7]、分子免疫學(xué)[8-9]、生態(tài)學(xué)[10]、食品開發(fā)與應(yīng)用[1]、養(yǎng)殖技術(shù)與應(yīng)用[11-12]等。

響應(yīng)面法(Response Surface Methodolody, 簡稱:RSM)是先進行合理的試驗方案設(shè)計, 后通過實驗論證得到相關(guān)的實驗數(shù)據(jù), 采用多元二次回歸方程擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系, 通過對回歸方程各參數(shù)的分析來尋求最優(yōu)參數(shù)并解決多變量問題的一種統(tǒng)計方法[13-14]。應(yīng)用軟件系統(tǒng)對試驗得到的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析, 觀察響應(yīng)面[15], 利用軟件提供的三維立體圖形和二維等高線圖, 最優(yōu)化試驗結(jié)果。響應(yīng)面法具有次數(shù)少、周期短, 所得回歸方程精度高等優(yōu)點, 可以研究幾種因素間的交互作用[16]。本文利用響應(yīng)面法, 探討溫度、鹽度和密度對波紋巴非蛤幼貝生長的聯(lián)合作用, 構(gòu)建波紋巴非蛤幼貝生長模型并優(yōu)化其生長條件, 以期對波紋巴非蛤大規(guī)模人工養(yǎng)殖提供科學(xué)理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用波紋巴非蛤幼貝均來自福建宏峰泰海洋生物開發(fā)有限公司育苗基地, 于2012年6月人工育苗成功, 選取殼長相近的幼貝用于實驗, 隨機抽取100粒幼貝測量殼長, 平均殼長為4.94 mm±0.07 mm。模型驗證實驗選取同批次幼貝, 幼貝規(guī)格與響應(yīng)面實驗開始時基本相同, 隨機抽取30粒幼貝測量殼長,平均殼長為5.04 mm±0.06 mm。

1.2 實驗設(shè)計

1.2.1 響應(yīng)面法分析實驗

在前期單因素實驗基礎(chǔ)上, 選取溫度、鹽度和密度3個影響因子的實驗組, 根據(jù)Box-Benhnken的中心實驗設(shè)計原理進行3因素3水平(3因素為溫度(A),鹽度(B), 密度(C); 3水平為－1, 0, 1)的二次多項回歸組合實驗, 探索波紋巴非蛤幼貝生長的最優(yōu)條件。實驗在500 mL燒杯中進行, 燒杯底部鋪設(shè)5 mm厚的底泥。不同溫度梯度由恒溫水槽控制, 通過添加淡水至天然海水(鹽度為32～33)中配置不同鹽度梯度。實驗進行 20 d, 每天早晚投喂塔胞藻(Pyramidomonassp.),各實驗組投喂餌料相同, 并在投喂前將藻液鹽度調(diào)至與實驗組相同。響應(yīng)面影響水平、因素編碼及實驗設(shè)計見表1和表2。

表1 實驗水平和因素設(shè)計Tab. 1 Factors and levels of the experiment

表2 響應(yīng)面3因素3水平實驗設(shè)計Tab. 2 The experiment design of 3 factors and 3 levels of RSM

1.2.2 模型驗證實驗

實驗條件按照響應(yīng)面優(yōu)化得出的最適生態(tài)環(huán)境條件進行, 實驗設(shè)置3個平行, 實驗時間和響應(yīng)面實驗相同, 為期 20 d, 實驗結(jié)束后統(tǒng)計各平行組的平均殼長和死亡個體數(shù)。

1.3 計算公式與數(shù)據(jù)分析

生長率:Rg=(L－L0)/L0

存活率:Rs=(D－D0)/D0

公式中L0,L分別表示實驗開始和結(jié)束時幼貝的殼長(單位: mm),D0,D分別表示實驗開始和結(jié)束時幼貝個數(shù)。

實驗數(shù)據(jù)用軟件SPSS17.0進行平均值、標準差及單因素方差A(yù)NOVA分析, 獨立樣本均數(shù)進行T檢驗, 其中P＜ 0.05認為有顯著差異,P＜ 0.01認為差異極顯著。采用SAS 9.2軟件對響應(yīng)面的實驗數(shù)據(jù)進行二次多項回歸擬合、方差分析、顯著性檢測和響應(yīng)面法分析。

2 結(jié)果

2.1 回歸模型和回歸方程的建立

綜合單因素影響的實驗結(jié)果, 以幼貝生長率為響應(yīng)值。采用SAS 9.2軟件計算多元回歸擬合, 建立二元回歸方程。實驗結(jié)果如表3所示。

表3 響應(yīng)面分析方案與實驗結(jié)果Tab. 3 Experimental result and scheme of RSM

通過 SAS軟件的響應(yīng)面回歸過程進行數(shù)據(jù)分析, 建立二次響應(yīng)面回歸模型, 求出最優(yōu)相應(yīng)因子水平。擬合得到的生長率(Y)對A,B,C的回歸方程為:

2.2 回歸方程系數(shù)的方差分析和顯著性檢驗

利用SAS 9.2統(tǒng)計軟件對Box-Behnken實驗設(shè)計中的各組合實驗數(shù)據(jù)進行方差分析和多元回歸分析(表 4)。

表4 二次多項式模型方差分析和多元回歸分析Tab. 4 Variance analysis of quadratic equation and significance test of regression

由表4可以看出, 本實驗總模型回歸顯著性檢測P值為0.0005, 遠小于0.01, 失擬項顯著性檢測P值為0.0695, 說明模型失擬不顯著, 回歸極顯著, 擬合方程可靠, 線性回歸(P=0.0005＜0.01)、二次回歸(P=0.0024＜0.01)和交互(P=0.0006＜0.01)都極顯著。說明模型是可行的。模型的校正決定系數(shù)為R2adj=0.9574, 說明該模型可以解釋95.74%影響值的變化, 只有4.26%不可以用于該模型。決定系數(shù)R2=0.9848, 說明該模型擬合程度良好, 實驗誤差很小, 可以用來分析和預(yù)測波紋巴非蛤幼貝生長率。從回歸方程各項系數(shù)的顯著性檢驗可知, 一次項A顯著,B,C極顯著; 交互項AB,BC極顯著,AC不顯著; 二次項A2,B2極顯著,C2不顯著。綜合以上數(shù)據(jù)分析結(jié)果, 可以看出3種生態(tài)因子對幼貝生長率影響的大小順序是:B＞A＞C。

2.3 波紋巴非蛤幼貝生長率響應(yīng)面分析

圖1 密度和溫度交互作用對波紋巴非蛤幼貝生長率響應(yīng)面圖和等高線圖Fig. 1 Response surface plot and contour plot showing the interactive effect of density and temperature on Paphia undulata growth rate

三維響應(yīng)面和二維等高線圖可以用來評價不同因子之間的相互作用對響應(yīng)值的影響。三維響應(yīng)面和二維等高線圖能夠直觀地表現(xiàn)出波紋巴非蛤幼貝生長率隨溫度、密度、鹽度的不同而產(chǎn)生的變化趨勢。溫度和密度不存在顯著交互作用(圖1)。從溫度和鹽度交互作用的響應(yīng)面圖可以看出, 響應(yīng)面分析圖呈現(xiàn)山丘形曲面, 從等高線圖看出, 等高線呈橢圓形, 溫度和鹽度存在顯著交互作用, 生長率有極大值(圖 2)。鹽度和密度存在一定的交互作用(圖3), 但響應(yīng)面沒有呈現(xiàn)出明顯山丘形。從各圖中最佳生長率相對于等高線位置的變化可以看出,鹽度對幼貝生長率影響最大, 溫度次之, 密度影響最小。

圖2 鹽度和溫度交互作用對波紋巴非蛤幼貝生長率響應(yīng)面圖和等高線圖Fig. 2 Response surface plot and contour plot showing the interactive effect of salinity and temperature on Paphia undulata growth rate

圖3 密度和鹽度交互作用對波紋巴非蛤幼貝生長率響應(yīng)面圖和等高線圖Fig. 3 Response surface plot and contour plot showing the interactive effect of density and silinity on Paphia undulata growth rate

通過對SAS9.2軟件模擬出的三維響應(yīng)面圖和等高線分析可以得出,ABC對應(yīng)的編碼值分別為A=-0.534,B= 0.696547,C= -0.6048, 根據(jù)回歸方程中的系數(shù)計算出的實際值溫度為 26.93℃、鹽度為31.39、密度為 1.12個/cm2, 理論最佳生長率為41.47%。

2.4 模型驗證實驗結(jié)果

對模型預(yù)測的結(jié)果進行驗證實驗, 驗證實驗結(jié)果如表5所示。

將模型驗證實驗得出的結(jié)果與響應(yīng)面預(yù)測結(jié)果進行對比(表 6)。從表中可以看出, 實驗得出結(jié)果和預(yù)測結(jié)果基本一致, 生長率僅相差0.83%, 所以響應(yīng)面法較為可靠。

表5 實驗結(jié)果驗證Tab. 5 Demonstration of test result

表6 驗證實驗結(jié)果與響應(yīng)面預(yù)測結(jié)果的對比Tab. 6 Comparison of the best condition and the predicted condition

3 討論

溫度和鹽度是影響海洋無脊椎動物胚胎發(fā)育和生長的重要因子, 有關(guān)溫度和鹽度對海洋雙殼貝類的影響常見于單因子實驗分析, 溫度和鹽度對櫛江珧(Atrina pectinata)[17]、織錦巴非蛤(Paphia textzle)[18]、毛蚶(Scapharca subcrenata)[19]等的單一因素影響均有報道, 但針對溫度和鹽度兩者對海洋雙殼貝類聯(lián)合作用的研究則相對較少, 目前有針對華貴櫛孔扇貝(Mimachlamys nobilis)[20]的報道, 密度因子對貝類生長的影響主要通過個體之間直接對空間和食物的競爭和對環(huán)境的影響反作用于自身的生長。養(yǎng)殖密度對貝類生長的影響前人已做過大量的研究,例如, 青蛤(Cyclina sinensis)稚貝不同放養(yǎng)密度的試驗結(jié)果表明[21], 青蛤稚貝的生長受到了放養(yǎng)密度的制約, 低密度養(yǎng)殖時其瞬時生長率最高, 隨著放養(yǎng)密度的增加, 瞬時生長率逐漸下降, 死亡率上升。

雖然在單因素實驗中, 溫度、鹽度和密度均對波紋巴非蛤幼貝生長有顯著影響, 但它們之間的交互作用對幼貝生長的影響有所不同。密度與相關(guān)生態(tài)因子聯(lián)合作用對貝類影響的報道也相對較少。對毛蚶的研究表明, 在適宜的范圍內(nèi), 鹽度和溫度對毛蚶受精卵孵化和幼蟲生長交互作用不顯著, 但將其中一個條件設(shè)為極限時, 交互作用顯著[22]。王雅倩等[23]對中國蛤蜊(Mactra chinensis)的研究顯示, 個體質(zhì)量和溫度交互對中國蛤蜊的耗氧率和排氨率的影響顯著(P＜0.05)。桑士田等[24]研究了溫度、鹽度及pH交互作用對菲律賓蛤仔(Ruditapes philippinarum)稚貝生長的影響, 結(jié)果表明, 溫度、鹽度及pH三者間對蛤仔稚貝生長無顯著交互作用。

本文對波紋巴非蛤的研究發(fā)現(xiàn), 溫度和鹽度、鹽度和密度對幼貝生長影響極顯著, 而溫度和密度影響不顯著, 說明鹽度對幼貝的生長是至關(guān)重要的。波紋巴非蛤是一種暖水性、在淺海生活的貝類, 對高鹽的耐受能力要強于對低鹽的耐受能力。李文波[25]研究了溫度對波紋巴非蛤消化酶的影響, 認為波紋巴非蛤腸淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶的活力最適溫度分別為40, 55, 30℃, 波紋巴非蛤成貝耐受的極限溫度范圍一般為 5～31℃, 最適溫度為 20～28℃[11]。響應(yīng)面預(yù)測實驗表明, 溫度為26.93℃時幼貝生長率最高,通過模型驗證實驗證實此溫度下幼貝生長率達到了42.30%, 與以上研究結(jié)果基本吻合。運用響應(yīng)面法進行分析, 擬合得到的生長率的二次響應(yīng)面回歸方程,軟件模擬分析后, 波紋巴非蛤幼貝最適生長環(huán)境組合是溫度為26.93℃、鹽度為31.39、密度為1.12 個/cm2,理論最佳生長率為 41.47%, 經(jīng)實驗驗證后, 得到的生長率為 42.30%, 與理論值相近, 證實了響應(yīng)面模型能較好地優(yōu)化波紋巴非蛤幼貝的生長條件。

4 結(jié)論

本文采用響應(yīng)面法研究了溫度、鹽度和密度三者交互作用對波紋巴非蛤幼貝生長的影響, 取得了以下結(jié)論: (1)鹽度因子對波紋巴非蛤幼貝生長至關(guān)重要, 適宜的鹽度和溫度對幼貝生長有極大地促進作用, 在實際養(yǎng)殖過程中要注意二者聯(lián)合效應(yīng)。(2)響應(yīng)面預(yù)測結(jié)果和實驗驗證結(jié)果十分接近, 響應(yīng)面法不僅減少多因素交互實驗次數(shù), 同時可靠地反應(yīng)出各研究因子對幼貝生長的影響程度, 準確地預(yù)測了實驗結(jié)果, 此方法在明確了影響因子的前提下,對分析多因子影響實驗效果較好。

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