胡麗萍, 黃曉婷, 張玲玲, 陸 維, 包振民

(1. 海洋生物遺傳學與育種教育部重點實驗室 中國海洋大學海洋生命學院, 山東 青島 266003; 2. 煙臺市水產(chǎn)研究所, 山東 煙臺 264000)

扇貝科(Pectinidae)有300多個現(xiàn)存種, 是雙殼貝類中重要的一支, 廣泛分布于世界的各大洋中, 并且具有重要的經(jīng)濟價值[1]。櫛孔扇貝(Chlamys farreri)、海灣扇貝(Argopecten irradians irradians)、蝦夷扇貝(Patinopecten yessoensis)、華貴櫛孔扇貝(Mimachlamys nobilis)是我國主要的扇貝養(yǎng)殖種類,養(yǎng)殖年產(chǎn)量達120萬t多, 居世界首位。隨著近年來扇貝養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展, 其遺傳育種研究取得顯著成果, 細胞遺傳學是遺傳育種研究的基礎, 也是開展遺傳育種工作的重要理論依據(jù)。扇貝的細胞遺傳學研究主要涉及核型分析、染色體鑒別、細胞遺傳學圖構(gòu)建以及染色體結(jié)構(gòu)和功能分析。由于扇貝染色體數(shù)目多, 形態(tài)接近, 很難從形態(tài)上區(qū)分不同的染色體, 這在較長一段時期內(nèi), 阻礙著細胞遺傳學研究的深入開展。到目前為止, 國內(nèi)外已有核型報道的扇貝僅有 14種, 開展了帶型研究的扇貝有 8種,近年來熒光原位雜交技術(shù)在扇貝細胞遺傳學中的應用, 加快了扇貝染色體的研究進程, 包括在扇貝染色體進化、細胞遺傳學圖構(gòu)建、功能基因定位等方面均取得了突破性進展[2-27]。本文總結(jié)近年來扇貝染色體研究的相關(guān)文獻, 對扇貝染色體研究方面近年來取得的成果進行綜述, 并對將來的應用前景作一展望。

1 染色體組型研究

染色體組型代表了一個物種或個體在染色體水平上的表型, 它主要包括兩部分內(nèi)容: 染色體數(shù)目和染色體形態(tài)。由于不同研究者所采用實驗條件的差異, 可能導致染色體組型分析結(jié)果略有不同。因而,染色體組型只能對物種染色體的特征做出較粗略的描述。目前國內(nèi)外有染色體組型報道的扇貝有14種(表1), 染色體數(shù)目主要為2n=26, 32, 38, 其中具有38條染色體的有10種, 32條的有3種, 26條的僅有1種, 為女王扇貝[19]。這些數(shù)據(jù)支持扇貝科祖先單倍體染色體數(shù)目為19的假說[28-29], 該假說基于4個屬的大部分物種單倍體染色體數(shù)目為19的事實。根據(jù)已報道的核型公式, 扇貝科種類的核型變化差異較大, 絕大多數(shù)既有m/sm類型又含有t/st類型的染色體, 僅有海灣扇貝的染色體全部為t/st類型。我國主要養(yǎng)殖的4種扇貝, 核型公式均有報道, 櫛孔扇貝的核型公式 6m+10sm+22st, 蝦夷扇貝的核型公式6m+10sm+16st+6t, 海灣扇貝的核型公式 6st+2st/t+24t, 華貴櫛孔扇貝的核型公式6m+26t。

目前, 扇貝科物種的染色體研究進展仍然比較緩慢, 這與該類群染色體研究的某些限制有關(guān)。一般來說,要想獲得比較滿意的分裂相, 以胚胎細胞取材較好,但這種取材方式受到貝類繁殖季節(jié)和取材的嚴重限制。此外, 利用生殖腺細胞同樣受到季節(jié)限制, 而且這一時期的染色體長度很小, 不利于進行常規(guī)核型分析[30]。如果利用成體的組織(如鰓), 雖然這種取材途徑具有方便、快捷, 并且不受季節(jié)的限制, 但是由于成體代謝速度較慢而得到的分裂相很少。培養(yǎng)細胞也是進行染色體研究的優(yōu)良材料, 但是軟體動物的細胞培養(yǎng)技術(shù)至今也沒有大的突破。另外, 貝類動物的染色體通常較小, 研究難度比較大, 很多種類的核型差別不大, 難以區(qū)分。這些因素都嚴重限制了貝類染色體研究的進程。

2 染色體帶型研究

顯帶技術(shù)能顯示染色體的內(nèi)部結(jié)構(gòu), 提供更多具染色體鑒定性特征的信息。它不僅能更準確地對同源染色體進行配對, 而且能更精細地分析染色體的結(jié)構(gòu)和變化。已在動、植物和人類染色體研究中成為鑒定染色體組或個別染色體、探討物種進化及分析物種分類等問題的有效手段之一。關(guān)于扇貝染色體帶型的報道, 國內(nèi)外文獻均不太多, 這很大程度上與貝類缺乏細胞培養(yǎng)體系, 難以得到高質(zhì)量的染色體標本有關(guān)。目前僅在少數(shù)物種中有過相關(guān)報道, 見表1。

2.1 C帶

C帶主要顯示染色體的異染色質(zhì)部分, 具有物種的染色體特異性, 即每條染色體上帶的數(shù)目、位置、寬窄及染色深淺等均具有相對的穩(wěn)定性, 可被用來鑒別染色體和研究染色體的結(jié)構(gòu)與功能。由于 C帶的多態(tài)性, 在研究物種的親緣關(guān)系和進化上也是非常有用的。目前僅有3種扇貝開展了C帶分析(表1),扇貝的C帶多位于著絲粒位置, 如女王扇貝, 其C帶主要為著絲粒帶及中間帶;Nodipecten nodosus的C帶主要存在于近著絲粒, 以及部分端部和中間區(qū)域;海灣扇貝的 C帶主要分布于著絲粒區(qū)、端部和少量中間區(qū)域。

2.2 NORs帶

NORs顯帶技術(shù)是用于顯示核仁組織區(qū)(NORs)的方法, 最初由Matsui和Sasaki報道[31]。不少研究者發(fā)現(xiàn), 銀染色的不是核糖體基因(rDNA)的本身,而是與核糖體轉(zhuǎn)錄有關(guān)的一種酸性蛋白。因此, 銀染色的是有轉(zhuǎn)錄活性的NORs, 一般NORs位于次縊痕的位置。不同物種NORs的位置和數(shù)目均不同, 甚至同一種物種的不同品種 NORs出現(xiàn)的頻率也存在多態(tài)性。因此, 常用這種方法研究物種進化、親緣關(guān)系。NORs帶在扇貝中的研究略多于C帶, 共有8個物種有過報道(表 1), 其中櫛孔扇貝 1～2對 NORs帶,Hinnites distortus1～2對 NORs帶, 女王扇貝 1～2對NORs帶,M. varia和南極扇貝有1對NORs帶, 海灣扇貝有2對NORs帶, 紫扇貝的NOR有3～5對NORs帶,N. nodosus有2～4對NORs帶。扇貝NORs帶出現(xiàn)多態(tài)現(xiàn)象, 這在其他雙殼貝類如貽貝中也報道過[32],暗示雙殼貝類個體/細胞間rDNA轉(zhuǎn)錄活性存在差異。另外, NORs帶的數(shù)目一般隨演化程度的提高由少變多, 扇貝NORs數(shù)據(jù)對揭示其進化關(guān)系有一定幫助。

2.3 熒光帶

熒光帶型是根據(jù)熒光染料(DAPI, PI, CMA3等)在染色體不同結(jié)構(gòu)區(qū)域顯示的顏色深淺不同而產(chǎn)生的帶型, 通常用于揭示染色體上的 AT/GC富含區(qū),該帶型可作為識別特定染色體的重要標志[30]。目前共有6種扇貝開展了熒光帶研究, 包括櫛孔扇貝, 蝦夷扇貝,H. distortus, 紫扇貝, 海灣扇貝和南極扇貝。扇貝的熒光帶主要出現(xiàn)在著絲粒, 端部以及少量中間區(qū)域, 與 C帶結(jié)果經(jīng)常呈現(xiàn)一致的現(xiàn)象, 都反映的是染色體上組成型異染色質(zhì)區(qū)域。

2.4 RE帶

應用限制行內(nèi)切酶(RE)特異性的識別位點, 在染色體上進行原位酶切, 通過染料染色使染色體表現(xiàn)出物種特有的帶型的方法。該方法僅在南極扇貝中有過報道, 分別應用AluI, HaeIII和Sau3A三種限制性內(nèi)切酶對染色體進行原位酶切, 僅 HaeIII酶切后產(chǎn)生出與C帶相似的帶型結(jié)果。

3 FISH技術(shù)在扇貝染色體研究中的應用

熒光原位雜交(Fluorescence in situ hybridization,簡稱FISH)技術(shù)是一種靈敏、快速、準確有效的染色體分析技術(shù), 已被廣泛用于動植物分子細胞遺傳學的研究, 如染色體鑒定、基因作圖及染色體進化等。隨著不同種類熒光探針的獲得, 雙殼貝類染色體的研究獲得快速的發(fā)展, 尤其是在2000年之后(表1)。目前, 該技術(shù)已應用在 10種扇貝中, 被定位的探針涉及 rDNA, 端粒序列, 基因, 大片段基因組文庫克隆(fosmid, BAC)。

3.1 rDNA基因的定位

利用FISH技術(shù)對rDNA的定位, 可以了解基因組中的核仁組織區(qū)域(NORs)的分布狀況, 與 NORs帶結(jié)果一致。在扇貝中, 共有10種扇貝的rDNA得到了定位(表 1)。18SrDNA在 6種扇貝包括女王扇貝、櫛孔扇貝、華貴櫛孔扇貝、歐洲大扇貝、南極扇貝和M. varia均顯示1對位點; 3種扇貝包括海灣扇貝、蝦夷扇貝和H. distortus顯示2對位點; 而紫扇貝染色體上顯示了6～7個位點。5S rDNA在女王扇貝、海灣扇貝、紫扇貝和華貴櫛孔扇貝顯示 2對信號位點, 但前三種扇貝的信號位點位于相同的染色體上鄰近區(qū)域, 而華貴櫛孔扇貝的5SrDNA信號分別位于兩條染色體上。在歐洲大扇貝、櫛孔扇貝、蝦夷扇貝、M. varia和H. distortus均顯示1對信號位點。

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rDNA的FISH定位結(jié)果已被用于扇貝的進化分析。如根據(jù)海灣扇貝和櫛孔扇貝的核型及 rDNA的定位結(jié)果, 支持扇貝科祖先的單倍體染色體數(shù)目為19, 且根據(jù)櫛孔扇貝擁有 1對 18SrDNA位點, 1對5SrDNA位點且位于相同染色體上, 而海灣扇貝擁有2對18SrDNA位點, 1對5SrDNA位點且分別位于3對染色體上, 認為櫛孔扇貝在進化地位上比較古老,而海灣扇貝為進化而來的[3]。根據(jù)南極扇貝和H.distortus擁有非端部的rDNA位點, 且均擁有38條染色體, 但核型公式不同, 推測在染色體進化過程中發(fā)生過染色體倒位[25]。而華貴櫛孔扇貝的18SrDNA定位在1對長的中部著絲粒染色體的著絲粒區(qū)域, 這在扇貝科物種甚至雙殼貝類中都是非常罕見的, 而且該扇貝染色體數(shù)目僅有 32條, 依據(jù)扇貝科祖先單倍體染色體數(shù)目為19的假說, 可以推測華貴櫛孔扇貝的這條長的中部著絲粒染色體是通過羅伯遜融合進化來的[6]。

3.2 端粒序列的定位

端粒是指染色體末端所特有的帽子片段。脊椎動物的端粒大部分為(TTAGGG)的核苷酸重復。而大部分貝類的端粒序列還是未知的。應用 FISH技術(shù),脊椎動物端粒序列(TTAGGG)7定位在 5種扇貝所有染色體端部, 包括櫛孔扇貝, 蝦夷扇貝, 華貴櫛孔扇貝, 紫扇貝和海灣扇貝, 因此重復序列(TTAGGG)n很有可能就是扇貝的端粒序列。

3.3 組蛋白H3基因的定位

組蛋白(histone)是所有真核生物染色體內(nèi)與DNA結(jié)合的堿性蛋白質(zhì)。不同生物中組蛋白基因在基因組中的排列不同, 沒有特定的排列方式, 而在拷貝數(shù)高的基因組中(＞100拷貝), 大部分的組蛋白基因呈串聯(lián)重復的基因簇形式存在。應用FISH技術(shù),組蛋白 H3基因已經(jīng)定位在了 4種扇貝的染色體上(表 1), 分別為櫛孔扇貝的一對亞中部著絲粒染色體短臂端部, 蝦夷扇貝的一對亞中部著絲粒染色體的短臂中部以及一對亞端部著絲粒染色體的長臂中部,華貴櫛孔扇貝的一對端部著絲粒染色體端的長臂端部, 海灣扇貝的一對端部著絲粒染色體的長臂的中部, 根據(jù)組蛋白H3基因在4種扇貝染色體上的位置及數(shù)目, 推測基因復制/缺失、倒位和易位在扇貝科物種染色體在進化過程中發(fā)生了重要作用。

3.4 大片段基因組文庫克隆的染色體定位

由于單/低拷貝基因常為1至數(shù)kb小片段DNA,進行FISH定位時雜交靈敏度和信號檢出率嚴重受限。大片段基因組文庫, 如Fosmid、P1、BAC、PAC等, 由于其較大的插入片段而成為實現(xiàn)單/低拷貝基因序列定位理想的探針來源, 利用大片段基因組文庫克隆制備成探針將大大提高單/低拷貝基因定位的成功率。隨著近年來基因組學研究的快速發(fā)展, 櫛孔扇貝的fosmid文庫[33], BAC文庫[34-35]得到構(gòu)建。利用櫛孔扇貝fosmid文庫, Zhang等[8]將19個fosmid克隆進行了FISH定位研究, 并利用其中8個克隆實現(xiàn)了櫛孔扇貝8對染色體的識別鑒定。利用櫛孔扇貝BAC基因組文庫, 郇聘等[9-11]和黃超等[13]將4個包含抗性基因的BAC克隆定位到染色體上。胡麗萍[14]利用BAC-FISH技術(shù)實現(xiàn)了櫛孔扇貝SSR遺傳連鎖圖譜與染色體圖譜的整合, 并篩選出一套可以識別櫛孔扇貝所有染色體的探針組合, 建立了包含70個標記的櫛孔扇貝細胞遺傳學圖譜。

4 問題與展望

扇貝的染色體研究, 相對于很多哺乳動物和植物而言還是非常滯后的, 還未見關(guān)于扇貝染色體的精細結(jié)構(gòu)的研究報道, 扇貝染色體識別鑒定、染色體進化的研究也還處于起步階段。隨著扇貝高密度遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建, 基因組計劃的開展, 建立扇貝BAC-FISH技術(shù)體系, 整合染色體圖譜與遺傳連鎖圖譜, 將有助于輔助扇貝基因組的拼接組裝, 揭示扇貝染色體的基本結(jié)構(gòu)與功能以及開展功能基因組的研究。

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