姜迎婭，龔聲輝，朱 麟

（海南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，海南省熱帶動植物生態(tài)學(xué)重點實驗室，海南 ?？?571158）

室內(nèi)穩(wěn)定的環(huán)境條件下飼養(yǎng)出來的寄生蜂釋放到野外多變的環(huán)境后，會對寄生蜂的生存造成很大的困難.經(jīng)調(diào)查，椰甲截脈姬小蜂的野外種群寄生率低、種群數(shù)量小、不能成功定殖是防治過程中的一大難題[4].那么，在野外環(huán)境條件下，椰甲截脈姬小蜂是否會產(chǎn)生適應(yīng)性，這是目前尚未涉及的問題.目前的研究主要是針對該蜂的生物學(xué)特性及基礎(chǔ)生態(tài)學(xué)的研究，對該蜂體內(nèi)各種適應(yīng)性酶同工酶的研究還未見報道.

因此，為弄清這一問題，采用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)，對椰甲截脈姬小蜂室內(nèi)外種群的過氧化物酶（POD）和酯酶（EST）同工酶進(jìn)行了比較研究，確定其同工酶酶譜，以部分理解該蜂是否適應(yīng)了野外多變的環(huán)境條件，以期獲得室內(nèi)外種群在不同生存條件下的差異性證據(jù)，同時也為椰心葉甲的可持續(xù)生物防治提供基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 蟲源

椰甲截脈姬小蜂室內(nèi)種群均由實驗室室內(nèi)飼養(yǎng)，種蜂由海南省儋州市森林植物防治檢疫站提供.飼養(yǎng)方法如下：將新鮮椰樹心葉與老葉裁剪為長短適中的長條，參雜混合，約30片為一捆，置于自主設(shè)計的養(yǎng)蟲盒內(nèi)，每個盒里放三捆，盒蓋中央覆蓋紗網(wǎng)以保證透氣及防止成蟲逃逸.每3d更換一次心葉，并用75%酒精擦拭消毒養(yǎng)蟲盒.飼養(yǎng)多代后挑選健康活躍的椰心葉甲2～4齡幼蟲，每盒200頭，將寄生蜂成蟲與椰心葉甲幼蟲按3∶1的數(shù)量接入養(yǎng)蟲盒內(nèi)，并用10%蜂蜜水補(bǔ)充營養(yǎng)，將養(yǎng)蟲盒置于室內(nèi)溫度25～26℃，相對濕度75%～80%，L∶D=12h∶12h的條件下飼養(yǎng)[4]，7d后挑取被寄生的椰心葉甲僵蟲2～3頭裝入一管口有脫脂棉的指形管內(nèi)，在上述飼養(yǎng)過程的相同條件下讓寄生蜂羽化.羽化的成蟲立即置于-40℃冰箱中保存?zhèn)溆?

椰甲截脈姬小蜂野外種群由如下方法獲得：將2011年5月至11月由?？谑?、儋州市、文昌市等地區(qū)采集到的椰心葉甲僵蟲帶回實驗室，每2～3頭裝入一管口有脫脂棉的指形管內(nèi)，將其放入與室內(nèi)種群相同的條件下發(fā)育，待成蟲羽化后立即將其置于-40℃冰箱中保存?zhèn)溆?

1.2 樣品制備

分別秤取椰甲截脈姬小蜂室內(nèi)種群和野外種群各0.03 g，放入冰凍的研缽內(nèi)，加預(yù)冷的0.2 mol/L pH 7.0磷酸緩沖液1 mL和少許石英砂，冰浴迅速研磨，然后再以1 mL磷酸緩沖液分幾次洗入2 mL離心管.4℃下10000 rpm離心10min，取上清液重復(fù)離心一次后的上清液即為酶的粗提液.按每管30 μL分裝后將樣品置于-20℃保存?zhèn)溆?

1.3 電泳及活性染色

采用垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳常規(guī)方法[5]，膠厚約1mm，分離膠濃度為10%，pH8.9；濃縮膠濃度為4%，pH 6.8，電極緩沖液為Tris-Gly（pH8.3），上樣量約為20 μL.在4℃條件下進(jìn)行電泳，采用恒壓60V電泳，當(dāng)指示劑跑到濃縮膠與分離膠界線時，升壓至100V，繼續(xù)電泳，待指示劑遷移至凝膠底部時，停止電泳，電泳時間約為5～7h.電泳完畢后，過氧化物酶同工酶采用醋酸聯(lián)苯胺法染色，酯酶同工酶采用堅牢藍(lán)RR鹽染色法染色.染色完畢經(jīng)蒸餾水沖洗后于7%醋酸溶液中固定.

2 結(jié)果與分析

2.1 過氧化物酶同工酶酶譜的比較

椰甲截脈姬小蜂室內(nèi)與野外種群POD同工酶電泳模式圖見圖1.按酶帶顏色深淺及寬窄可分為強(qiáng)帶、次強(qiáng)帶和弱帶.酶帶顏色的深淺代表酶活性，顏色越深，活性越強(qiáng)；酶帶寬窄代表酶的含量，酶帶越寬，酶含量越高[6].兩個種群共顯示5種遷移率不同的POD同工酶帶，遷移率在0.038～0.208之間，同一種酶帶的遷移率基本相同（見表1）.從陰極到陽極依次將酶帶編號為P1、P2、P3、P4、P5.

圖1 椰甲截脈姬小蜂室內(nèi)外種群POD同工酶電泳模式圖Fig.1 Peroxidase isozyme schematic diagram of laboratory and field populations of Asecodes hispinarum

表1 椰甲截脈姬小蜂室內(nèi)外種群POD同工酶酶帶相對遷移率Tab.1 Peroxidase isozyme mobility of laboratory and field populations of Asecodes hispinarum

由圖1可知，椰甲截脈姬小蜂兩個種群的POD同工酶酶帶可以分為兩個染色區(qū)段，第一區(qū)段包括遷移率為0.038和0.075的兩條酶帶，剩下3條同屬于第二區(qū)段.第一區(qū)段兩條酶帶的顏色比第二區(qū)段淺，而且窄，均為弱帶；第二區(qū)段的酶帶較強(qiáng).兩個種群的酶譜存在較明顯的差異，野外種群有5條同工酶帶，比室內(nèi)種群多了一條遷移率為0.038的P1酶帶,其余4條酶帶為兩個種群共有，但野外種群酶帶的顏色普遍比室內(nèi)種群的深，表明其POD活性比室內(nèi)種群強(qiáng).另外室內(nèi)種群的P2酶帶比野外種群的P2酶帶稍窄，表明此處野外種群的POD酶含量較室內(nèi)種群高.

2.2 酯酶同工酶酶譜的比較

經(jīng)多次重復(fù)試驗比較，其特征酶譜穩(wěn)定性和重復(fù)性較好，說明以酯酶同工酶作為椰甲截脈姬小蜂的生化比較指標(biāo)具有一定的可靠性.室內(nèi)外種群的EST同工酶電泳模式圖見圖2.其酶譜共顯示6種遷移率不同的EST同工酶酶帶，同一種酶帶的遷移率基本相同（見表2）.從陰極到陽極可將酶帶分為A、B、C、D四個染色區(qū)，依次將酶帶編號為A1、A2、B1、C1、C2、D1.

圖2 椰甲截脈姬小蜂室內(nèi)外種群EST同工酶電泳模式圖Fig.2 Esterase isozyme schematic diagram of laboratory and field populations of Asecodes hispinarum

表2 椰甲截脈姬小蜂室內(nèi)外種群EST同工酶酶帶相對遷移率Tab.2 Esterase isozyme mobility of laboratory and field populations of Asecodes hispinarum

由圖2可知，室內(nèi)種群共顯示5條酶帶，而野外種群有6條酶帶，A、B、C區(qū)兩種群均有分布且有相同的的遷移率，但每條酶帶的顏色深淺及寬窄存在差異.室內(nèi)、野外種群的酶帶A1寬窄與顏色深淺比較相似，均為極強(qiáng)帶，室內(nèi)種群相比于野外種群酶帶A2、C1、C2的顏色要稍許深些，分別為強(qiáng)帶、較弱帶、極強(qiáng)帶，而野外種群的分別為較強(qiáng)帶、弱帶、強(qiáng)帶.室內(nèi)種群相比于野外種群缺少D區(qū)Rf=0.58的D1酶帶.

3 討論

酶的變化可以反應(yīng)生物的多種適應(yīng)性變化.從實驗的結(jié)果來看，椰甲截脈姬小蜂室內(nèi)種群與野外種群過氧化物酶及酯酶同工酶的酶譜存在較明顯的差異，說明該蜂為適應(yīng)野外的環(huán)境已經(jīng)發(fā)生了適應(yīng)性的變化.

楊秀芬等[7]在對異色瓢蟲10種色斑型的EST同工酶研究中表明，在不同生態(tài)環(huán)境下相同色斑型的異色瓢蟲酶譜不同.椰甲截脈姬小蜂在室內(nèi)和野外兩種不同的生態(tài)環(huán)境下，POD和EST酶譜均存在差異，但兩個種群的酶譜相似程度仍然比較高，因此，變化的程度仍需進(jìn)一步詳細(xì)的研究.

生物的遺傳變異反映了生物群體內(nèi)多態(tài)等位基因的存在，是生物進(jìn)化的先決條件，也是同工酶技術(shù)在研究生物分類及系統(tǒng)進(jìn)化中得以應(yīng)用的理論基礎(chǔ)[8].同工酶作為基因表達(dá)的直接或間接產(chǎn)物，它們的豐富程度直接影響生物體的機(jī)能和對環(huán)境的適應(yīng)能力.同工酶多態(tài)性越高，越復(fù)雜，表明其遺傳多樣性越豐富，群體更能適應(yīng)環(huán)境[9].通過對椰甲截脈姬小蜂室內(nèi)外種群POD同工酶和EST同工酶酶譜的比較，可以看到野外種群比室內(nèi)種群的POD多一條Rf=0.038的酶帶，EST也多一條Rf=0.58的酶帶，這也許就是該蜂為適應(yīng)野外多變的環(huán)境微進(jìn)化反應(yīng).

所有需氧生物的生理過程均有自由基的產(chǎn)生和消除，并且兩者存在動態(tài)平衡，如果失去平衡，便會對機(jī)體造成損傷引起病變[10].同樣，昆蟲也有一套由過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化物酶（POD）等抗氧化酶組成的抗氧化系統(tǒng)，用以減少氧化脅迫.有研究表明，昆蟲的保護(hù)酶系統(tǒng)與昆蟲的耐熱性有關(guān)[11].從本實驗結(jié)果來看，椰甲截脈姬小蜂野外種群POD活性比室內(nèi)種群強(qiáng)，其原因可能就是該蜂的野外種群采自海南的5月至11月，這段時間的溫度比室內(nèi)的25℃左右的溫度高，為了更好的適應(yīng)相對較高溫的環(huán)境，提高機(jī)體的耐熱性，增加POD的活性，有利于清除過氧化氫，平衡體內(nèi)的自由基.

孫蕊芬等[3]比較了椰甲截脈姬小蜂野外種群和室內(nèi)種群的雌雄比、出蜂量、未出蜂量、懷卵量的差異，表明野外種群和室內(nèi)種群已經(jīng)出現(xiàn)了明顯的分化，室內(nèi)條件與野外條件確實能造成種群的分化.研究兩個種群的過氧化物酶和酯酶，為兩個種群的差異性提供了生化上的證據(jù).但結(jié)果是初步的.仍有許多復(fù)雜的適應(yīng)性問題需要進(jìn)一步研究.現(xiàn)從生物學(xué)和生化的角度均證明，椰甲截脈姬小蜂釋放到野外后發(fā)生了適應(yīng)性的變化，如果能對這種變化加以人為的利用，建立起真正適應(yīng)野外生存的種群，對椰心葉甲的防治將具有十分重要的意義.

[1]金化亮,陳青,金啟安,等.熱脅迫對椰甲截脈姬小蜂生長發(fā)育和繁殖的影響[J].熱帶作物學(xué)報,2010,31(4)：631-635.

[2]李朝緒,覃偉權(quán),黃山春,等.海南利用寄生蜂防治椰心葉甲效果分析[J].林業(yè)科技開發(fā),2008,22(1)：41-44.

[3]孫蕊芬,田小青,張先敏,等.椰甲截脈姬小蜂野外種群與實驗種群差異性比較[J].應(yīng)用昆蟲學(xué)報,2011,48(4)：934-940.

[4]孫蕊芬.溫度對椰甲截脈姬小蜂適應(yīng)性的影響[D].?？冢汉Ｄ蠋煼洞髮W(xué),2011.

[5]郭堯君.蛋白質(zhì)電泳實驗技術(shù)[M].北京：科學(xué)出版社,2006：42-84.

[6]趙莉,曲延英,岳不昌,等.新疆兩種粉虱的酯酶和過氧化物酶同工酶的比較研究[J].植物保護(hù),2002,28(4)：17-18.

[7]楊秀芬,宗良炳.異色瓢蟲不同色斑型酯酶同工酶研究[J].河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,1991,14(1)：55-60.

[8]齊寶瑛,鄭哲民.昆蟲學(xué)研究中同工酶電泳及PCR-RAPD技術(shù)的應(yīng)用[J].內(nèi)蒙古師范大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版,2002,31(3)：252-261.

[9]高保全,劉萍,李健,等.三疣梭子蟹野生群體同工酶的遺傳多態(tài)性分析[J].水產(chǎn)學(xué)報,2007,31(1)：1-6.

[10]李毅平,龔和.昆蟲體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)研究進(jìn)展[J].生命科學(xué),1998,10(5)：240-243.

[11]李志明,陳青,唐超,等.高溫對椰心葉甲嚙小蜂保護(hù)酶系活性的影響[J].熱帶作物學(xué)報,2010,31(6)：994-998.