李宇晟，張 旭，胡曉鳳，丁學(xué)知，夏立秋，胡勝標(biāo)

(湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖南省微生物分子生物學(xué)國家重點實驗室培育基地，中國長沙 410081)

蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis，簡稱Bt)是一種革蘭陽性細(xì)菌，廣泛分布于土壤中.由于Bt在芽胞形成期能產(chǎn)生具有殺蟲活性的晶體蛋白，現(xiàn)已被應(yīng)用于農(nóng)林害蟲的生物防治［1］.為了提高Bt的殺蟲毒力、拓寬殺蟲譜、延緩昆蟲抗性產(chǎn)生，利用外源基因?qū)隑t野生型菌株中以構(gòu)建具有更高殺蟲活力、殺蟲譜更廣的工程菌已成為國內(nèi)外微生物農(nóng)藥發(fā)展的重要方向［2］.外源基因?qū)隑t野生型菌株中常用的方法有原生質(zhì)體融合、接合轉(zhuǎn)移、電穿孔等.其中，原生質(zhì)體融合和接合轉(zhuǎn)移存在操作繁鎖、難度較大、穩(wěn)定性差、轉(zhuǎn)化率低等缺點［3-4］，而電穿孔轉(zhuǎn)化所需設(shè)備簡單、方法簡便、轉(zhuǎn)化效率相對較高，被廣泛運用于Bt工程菌的構(gòu)建工作中［5-6］.

由于Bt屬于革蘭氏陽性菌，在生理狀態(tài)和細(xì)胞結(jié)構(gòu)上與革蘭陰性菌，如大腸桿菌(Escherich coli，簡稱E.coli)，存在很大差異，電轉(zhuǎn)化方法在Bt中的使用并不十分完善，其電轉(zhuǎn)化效率和重復(fù)性都還有待進(jìn)一步提高［7］.在以往相關(guān)Bt電轉(zhuǎn)化方法的報道，多集中在質(zhì)粒鹽離子濃度、電轉(zhuǎn)化緩沖液、電轉(zhuǎn)化參數(shù)等方面，不同實驗組、不同Bt菌株間的電轉(zhuǎn)化方法和效率存在較大的差異.本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，質(zhì)粒加入Bt感受態(tài)細(xì)胞中很容易被降解，低濃度的質(zhì)粒直接影響了電轉(zhuǎn)化效率，而經(jīng)蛋白酶K處理后的Bt感受態(tài)細(xì)胞對質(zhì)粒的降解作用大大下降，顯著提高了轉(zhuǎn)化效率.研究還對電轉(zhuǎn)化相關(guān)因素進(jìn)行了優(yōu)化，包括培養(yǎng)基成分及滲透壓、培養(yǎng)時間、電轉(zhuǎn)化緩沖液、電場壓、質(zhì)粒DNA的濃度等.利用該方法，在Bt中建立了一種穩(wěn)定高效的電轉(zhuǎn)化方法.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 Bt 4.0718(CCTCC No.M200016)為本研究室選育的野生型Bt菌株.Bt菌株培養(yǎng)溫度為30℃.質(zhì)粒pHT315為E.coli-Bt穿梭載體，含有氨芐青霉素(Ampicillin)抗性基因(E.coli中的篩選基因)和紅霉素(Erythromycin)抗性基因(Bt中的篩選基因).

1.1.2 培養(yǎng)基、緩沖液和試劑 BHI培養(yǎng)基:腦心浸液(Brian Heart Infusion，BHI)20 g/mL;BHIS培養(yǎng)基:BHI培養(yǎng)基中加入0.5 mol/L山梨醇;電轉(zhuǎn)化緩沖液A:0.5 mol/L山梨醇，0.5 mol/L甘露醇，體積分?jǐn)?shù)為10%的甘油(下同);電轉(zhuǎn)化緩沖液B:275 mmol/L蔗糖，10%甘油;電轉(zhuǎn)化緩沖液C:272 mmol/L蔗糖，0.5 mmol/L MgCl2;蛋白酶K:10 g/L;紅霉素:25 mg/L.

1.2 方法

1.2.1 引物 根據(jù)pHT315質(zhì)粒上紅霉素抗性基因(erm)序列，設(shè)計引物對:Erm-S:ATGCCCTTAGAAGCAAACTTAAG;Erm-A:CCGATACAAATTCCCCGTAGG.

1.2.2 Bt感受態(tài)細(xì)胞的制備 接種Bt菌株于10 mL培養(yǎng)基中(BHI培養(yǎng)基和BHIS培養(yǎng)基)，30℃震蕩過夜培養(yǎng).按體積2%的接種量轉(zhuǎn)接入50 mL新鮮BHIS培養(yǎng)基中，30℃震蕩培養(yǎng)，定時取樣并在分光光度計(Bio-Rad SmartSpec plus，美國)上測定OD600值.將菌體在冰上放置10 min，收集菌體.用500 μL電轉(zhuǎn)化緩沖液懸浮細(xì)胞，加入5 μL 10 g/L蛋白酶K(終濃度1 g/L)，37℃孵育20 min.4℃，6 000 r/min離心5 min收集菌體，用預(yù)冷電轉(zhuǎn)化緩沖液洗滌細(xì)胞2次，用500 μL預(yù)冷的電轉(zhuǎn)化緩沖液重懸細(xì)胞并分裝到無菌Ep管中(100 μL/管)，－80 ℃冷凍保存待用.

1.2.3 電轉(zhuǎn)化 取Bt感受態(tài)細(xì)胞1管(100 μL)，手溫溶化，取100 ng pHT315質(zhì)粒與之重發(fā)混勻，轉(zhuǎn)入電轉(zhuǎn)化杯中，設(shè)置電擊轉(zhuǎn)化儀(Eppendorf 2510，德國)的電壓值，將轉(zhuǎn)化杯置于電擊槽中電擊一次.電擊完畢后立即冰上放置5 min，向杯中加入900 μL BHIS培養(yǎng)基，30℃ 1000 r/min培養(yǎng)2 h，涂布含有紅霉素(25 mg/L)的BHIS平板，培養(yǎng)12～24 h.實驗重復(fù)3次，計算轉(zhuǎn)化子平均數(shù)目.

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞生長時期對轉(zhuǎn)化效率的影響

Bt 4.0718菌株30℃震蕩培養(yǎng)，定時取樣并測定細(xì)胞量(OD600值)，分別制備感受態(tài)細(xì)胞、電轉(zhuǎn)化pHT315質(zhì)粒，挑選轉(zhuǎn)化子用引物對(Erm-S/Erm-A)進(jìn)行菌落PCR鑒定，所獲得轉(zhuǎn)化子均為陽性(圖1).當(dāng)Bt 4.0718 菌株細(xì)胞生長到 OD600值0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 時，在紅霉素平板分別獲得 35、107、294、321、126個轉(zhuǎn)化子(圖2).這說明，當(dāng)Bt 4.0718菌株細(xì)胞OD600值達(dá)0.6～0.8時，最適合進(jìn)行感受態(tài)細(xì)胞的制備，此時電轉(zhuǎn)化效率最高.

圖1 菌落PCR檢測Bt轉(zhuǎn)化子Fig.1 Identification of Bt transformants by Colony PCR

圖2 Bt細(xì)胞生長量對電轉(zhuǎn)化效率的影響Fig.2 Effect of Bt cell growth phase on transformation efficiency

2.2 蛋白酶K對Bt轉(zhuǎn)化效率的影響

將pHT315質(zhì)粒分別與未經(jīng)蛋白酶K處理和經(jīng)蛋白酶K處理的Bt感受態(tài)細(xì)胞孵育一段時間，觀察質(zhì)粒DNA量的變化.未處理的Bt感受態(tài)細(xì)胞與1 μg pHT315混合后孵育1 min，有將近50%(500 ng)的pHT315被降解;隨著孵育時間延長，這種降解作用越來越大，當(dāng)孵育時間達(dá)到10 min，剩下的pHT315質(zhì)粒大約只有原來的20%(200 ng).而Bt感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)蛋白酶K(終濃度為1 g/L)處理20 min后再與pHT315質(zhì)粒孵育，這種降解作用大大減弱:即使孵育10 min后，剩余的質(zhì)粒還有原來的80%(800 ng)左右(圖3).因為Bt感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)1 g/L的蛋白酶K處理后對質(zhì)粒DNA的降解作用減弱，最終獲得的轉(zhuǎn)化子數(shù)量增加了近30倍.

圖3 Bt感受態(tài)細(xì)胞對質(zhì)粒pHT315的降解作用Fig.3 The degration effect of Bt competent cells to pHT315

2.3 培養(yǎng)基中加入山梨醇對電轉(zhuǎn)化率的影響

傳統(tǒng)電轉(zhuǎn)化方法中多使用BHI作為培養(yǎng)基，而電轉(zhuǎn)化緩沖液多為高滲環(huán)境，這樣細(xì)胞容易迅速死亡，從而影響電轉(zhuǎn)化效率.利用BHI培養(yǎng)Bt 4.0718菌株制備的感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行pHT315質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化，最后獲得83個轉(zhuǎn)化子.當(dāng)在BHI中添加了0.5 mol/L山梨醇(BHIS培養(yǎng)基)，相同條件下進(jìn)行電轉(zhuǎn)化，獲得的轉(zhuǎn)化子數(shù)目達(dá)到327個，轉(zhuǎn)化率提高了近4倍.

2.4 電轉(zhuǎn)緩沖液對電轉(zhuǎn)化率的影響

為了獲得最佳Bt電轉(zhuǎn)緩沖液，對3種電轉(zhuǎn)緩沖液進(jìn)行了比較.在相同的條件下，電轉(zhuǎn)化緩沖液A(0.5 mol/L山梨醇，0.5 mol/L甘露醇，10%甘油);電轉(zhuǎn)化緩沖液B(275 mmol/L蔗糖，10% 甘油);電轉(zhuǎn)化緩沖液C(272 mmol/L蔗糖，0.5 mmol/L MgCl2)分別獲得轉(zhuǎn)化子數(shù)目分別為297、314、308個，表明3種電轉(zhuǎn)緩沖液對Bt電轉(zhuǎn)化效率影響差別不大.

2.5 電轉(zhuǎn)化參數(shù)對電轉(zhuǎn)化率的影響

電轉(zhuǎn)化參數(shù)中，電壓對電轉(zhuǎn)化效率的影響最大.在1.5～2.5 kV的電壓范圍內(nèi)進(jìn)行電轉(zhuǎn)化.當(dāng)電壓為1 500、1 800、2 000、2 300、2 500 V 時，分別獲得204、329、281、203、183 個轉(zhuǎn)化子(圖4).電壓從1 500 V增加到1 800 V，轉(zhuǎn)化子數(shù)目增加了125個，當(dāng)電壓繼續(xù)增加時電擊常數(shù)下降，2 500 V時的電擊常數(shù)只有3.6 ms.電壓增加導(dǎo)致電擊常數(shù)下降，令轉(zhuǎn)化子數(shù)量反而減少.因此，對Bt 4.071 8菌株進(jìn)行電轉(zhuǎn)時電壓為1 800 V為最佳.

圖4 電壓對Bt電轉(zhuǎn)化效率的關(guān)系Fig.4 The effect of voltage on Bt electroporation efficiency

3 討論

文獻(xiàn)報道，許多細(xì)菌能合成核酸酶［8］，這些核酸酶大多分泌到胞外，能迅速降解環(huán)境中的DNA.在電轉(zhuǎn)化過程中，這些胞外核酸酶對質(zhì)粒DNA的降解作用大大降低電轉(zhuǎn)化效率.本研究發(fā)現(xiàn)，將Bt感受態(tài)細(xì)胞與質(zhì)粒DNA孵育后，短時間內(nèi)大量的DNA被降解，而經(jīng)過終濃度為1 g/L的蛋白酶K處理后的Bt感受態(tài)細(xì)胞對質(zhì)粒的降解作用就變得很小.由此推測:Bt細(xì)胞能表達(dá)分泌核酸酶，它們對質(zhì)粒的降解作用對電轉(zhuǎn)化效率具有負(fù)面影響.蛋白酶K處理Bt細(xì)胞時間以20 min為最佳，時間太短則核酸酶不能充分消化，時間太長可能導(dǎo)致Bt細(xì)胞死亡.

Bt細(xì)胞的培養(yǎng)是影響電轉(zhuǎn)化效率的一個關(guān)鍵因素.當(dāng)OD600在0.6～0.8時，Bt細(xì)胞處于對數(shù)生長中期，細(xì)胞生長旺盛，細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定期細(xì)胞相對疏松，有利于孔洞的形成和外源DNA通過孔洞進(jìn)入細(xì)胞［9］，從而提高電轉(zhuǎn)化效率.而培養(yǎng)基的成分也將影響到Bt電轉(zhuǎn)化效率.以往在制備Bt感受態(tài)細(xì)胞過程中，直接將菌體轉(zhuǎn)移到高滲電轉(zhuǎn)化緩沖液當(dāng)中，而滲透壓的突然改變會對細(xì)胞產(chǎn)生有害作用，導(dǎo)致細(xì)胞大量死亡，獲得的轉(zhuǎn)化子數(shù)目非常少.當(dāng)在BHI培養(yǎng)基中加入0.5 mol/L山梨醇后，細(xì)胞有了適應(yīng)高滲電轉(zhuǎn)化緩沖液的能力，細(xì)胞存活率大大提高，而且復(fù)蘇培養(yǎng)基中山梨醇的加入，使得Bt感受態(tài)細(xì)胞電擊以后，細(xì)胞得到了高滲溶液的有效保護(hù)，細(xì)胞死亡率大大降低，也有利于提高電轉(zhuǎn)效率［10-11］.

影響電轉(zhuǎn)效率的另一個因素是電擊參數(shù)中的電壓值.電穿孔轉(zhuǎn)化的主要原理是利用瞬時的高強度電場使細(xì)胞膜的滲透性發(fā)生改變，從而使DNA順利進(jìn)入細(xì)胞內(nèi).電擊過程中，電壓過低，細(xì)胞難以極化產(chǎn)生孔洞，DNA不能進(jìn)入;電壓過高，則會因細(xì)胞膜損傷過大而死亡，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率的降低［12］.對于不同的細(xì)菌細(xì)胞，電壓值存在較大差異.作者的研究表明，在1 800 V時，Bt 4.071 8菌株能獲得最多的轉(zhuǎn)化子.

此外，還存在其他一些影響B(tài)t電轉(zhuǎn)化效率的因素:不同Bt菌株轉(zhuǎn)化效率存在差異;大分子量質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化效率要低于小分子量質(zhì)粒;同一質(zhì)粒的超螺旋型電轉(zhuǎn)化效率要高于開環(huán)狀和線性質(zhì)粒;使用低濃度抗生素篩選轉(zhuǎn)化子比高濃度抗生素能獲得更多轉(zhuǎn)化子.

本研究通過優(yōu)化電轉(zhuǎn)化過程中的關(guān)鍵因素，獲得了適用Bt的高效電轉(zhuǎn)化條件:Bt生長在含有0.5 mol/L山梨醇的BHI培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)OD600至0.6～0.8，感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)1 g/L蛋白酶K處理20 min，電壓為1 800 V時，可以獲得最高轉(zhuǎn)化效率.

［1］HU S B，LIU P，DING X Z，et al.Efficient constitutive expression of chitinase in the mother cell of Bacillus thuringiensis and its potential to enhance the toxicity of Cry1Ac protoxin ［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2009，82(6):1157-1167.

［2］GUAN P，AI P，DAI X，et al.Complete genome sequence of Bacillus thuringiensis serovar sichuansis strain MC28［J］.J Bacteriol，2012，194(24):6975.

［3］XIAO M H，BJARNE M H，JORGEN E.Conjugative transfer，stability and expression of a plasmid encoding a cry1Ac gene in Bacillus cereus group strains［J］.FEMS Microbiol Lett，2004，231(4):45-52.

［4］YU J，PANG Y，TANG M，et al.Highly toxic and broad-spectrum insecticidal Bacillus thuringiensis engineered by using the transposon Tn917 and protoplast fusion ［J］.Curr Microbiol，2001，43(6):112-119.

［5］PENG D，LUO Y，GUO S，et al.Elaboration of an electroporation protocol for large plasmids and wild-type strains of Bacillus thuringiensis［J］.J Appl Microbiol，2009，106(6):1849-1858.

［6］MONTHES H C，RUIZ M R，MAGANA P I.Efficient transformation of Cellulomonas flavigena by electroporation and conjugation with Bacillus thuringiensis［J］.Curr Microbiol，2004，49(8):428-432.

［7］MESRATI L A，KARRAY M D，TOUNSI S，et al.Construction of a new high-copy number shuttle vector of Bacillus thuringiensis［J］.Lett Appl Microbiol，2005，41(4):361-366.

［8］PEDIADITAKIS M，KAUFENSTEIN M，GRAUMANN P L.Bacillus subtilis hlpB encodes a conserved stand-alone HNH nuclease-like protein that is essential for viability unless the hlpB deletion is accompanied by the deletion of genes encoding the Add-AB DNA repair complex［J］.J Bacteriol，2012，194(22):6184-6194.

［9］TROND E V A，F(xiàn)INN L A.Methodologies to increase the transformation efficiencies and the range of bacteria that can be transformed ［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2010，85(5):1301-1313.

［10］FATMA M M，CARLOS D，MARC B.High transformation efficiency of Bacillus subtilis with integrative DNA using glycine betaine as osmoprotectant［J］.Anal Biochem，2012，424(2):127-129.

［11］ZHANG H L，LI Y T，CHEN X M，et al.Optimization of electroporation conditions for Arthrobacter with plasmid PART2［J］.J Microbiol Meth，2011，84(1):114-120.

［12］LANCKRIET A，TIIMBERMONT L，HAPPONEN L J，et al.Generation of single-copy transposon insertions in clostridium perfringens by electroporation of phage Mu DNA transposition complexes［J］.Appl Environ Microbiol，2009，75(9):2638-2642.