張新新，游婷，劉海霞，印紅

（河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北保定 071002）

血藍(lán)蛋白是節(jié)肢動(dòng)物和軟體動(dòng)物血淋巴中的含銅呼吸蛋白，脫氧狀態(tài)為無(wú)色，結(jié)合氧狀態(tài)為藍(lán)色［1］.節(jié)肢動(dòng)物血藍(lán)蛋白由6個(gè)相同或相似的分子質(zhì)量在75ku左右的單體組成［2］.一個(gè)典型的節(jié)肢動(dòng)物血藍(lán)蛋白亞基分為3個(gè)結(jié)構(gòu)域，第1個(gè)結(jié)構(gòu)域包括N端的150～180個(gè)氨基酸，由6～7個(gè)α螺旋組成，并通過(guò)超二級(jí)結(jié)構(gòu)形成穩(wěn)定的螺旋束；第2個(gè)結(jié)構(gòu)域?yàn)榛钚晕稽c(diǎn)，由4個(gè)α螺旋束結(jié)合2個(gè)銅離子——CuA和CuB，每個(gè)α螺旋有3個(gè)His殘基與Cu＋結(jié)合，這2個(gè)Cu＋為血藍(lán)蛋白結(jié)合O2所必需；第3個(gè)結(jié)構(gòu)域是C端，主要由β折疊結(jié)構(gòu)組成，進(jìn)一步折疊反平行的7股β桶超二級(jí)結(jié)構(gòu)［3－4］.每個(gè)亞基的3個(gè)結(jié)構(gòu)域在六聚體中有序排列.節(jié)肢動(dòng)物血藍(lán)蛋白屬于一類蛋白質(zhì)家族，其包括酚氧化酶（phenoloxidases，PO）、甲殼類假血藍(lán)蛋白（crustacean pseudo－h(huán)emocyanins，又名cryptocyanin，PHc或Cc）、昆蟲(chóng)存儲(chǔ)蛋白（insect storage hexamerins，Hx）、雙翅類六聚蛋白受體（dipteran hexamerin receptors，HxR）［5］.血藍(lán)蛋白作為三類呼吸功能蛋白之一，不僅承擔(dān)著氧氣傳輸?shù)墓δ?，而且它還具備能量?jī)?chǔ)存和免疫防御功能［6－7］，血藍(lán)蛋白在實(shí)驗(yàn)中顯示出酚氧化酶活性，甚至可以轉(zhuǎn)化為酚氧化酶［8－10］.此外，血藍(lán)蛋白可以結(jié)合蛻皮激素而參與其在血淋巴中的運(yùn)輸［6，11］.研究表明，血藍(lán)蛋白廣泛存在于直翅目昆蟲(chóng)中，但目前相關(guān)研究非常少，迄今只有Sanchez等［12］在美洲沙漠蝗Schistocercaamericana的胚胎中調(diào)取了Hc1的部分序列，Yin等［13］獲取了東亞飛蝗Locustamigratoria manilensisHc1的完整序列.東亞飛蝗Locustamigratoriamanilensis（Mey.）屬于直翅目Orthoptera，蝗總科Aeridoidea，斑翅蝗科Oedipodidae，飛蝗屬LocustaLinnaeus，是一種重要的農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)，是誘發(fā)蝗災(zāi)的一個(gè)重要的蝗蟲(chóng)種類［14］.本實(shí)驗(yàn)以東亞飛蝗Locustamigratoriamanilensis為研究對(duì)象，在獲得其Hc1的cDNA完整序列和進(jìn)行初步分析的基礎(chǔ)上［13］，進(jìn)而構(gòu)建Hc1原核表達(dá)載體，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3）表達(dá)系統(tǒng)中，SDS－PAGE電泳表明：經(jīng)過(guò)IPTG誘導(dǎo)，目的基因可以高效表達(dá)［16］.同時(shí)預(yù)測(cè)了LmiHc1蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)，以期進(jìn)一步探討直翅目昆蟲(chóng)Hc1的功能和作用機(jī)理，進(jìn)而為害蟲(chóng)的生物防治以及昆蟲(chóng)資源的開(kāi)發(fā)利用奠定理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

E.coliTrans1－T1，E.coliBL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司.原核表達(dá)載體pET－DsbA由河北大學(xué)柳峰松老師惠贈(zèng).東亞飛蝗由本實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng).LATaq聚合酶、2 000u核酸分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、T4DNA連接酶（快速連接試劑盒）、BamHⅠ，HindⅢ限制性內(nèi)切酶、DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒為Takara公司產(chǎn)品，異丙基硫代P－D－半乳糖苷（IPTG）為AMRESCO產(chǎn)品，質(zhì)粒小量制備試劑盒、蛋白質(zhì)Marker系TransGen產(chǎn)品，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純.

1.2 方法

1.2.1LmiHc1基因的PCR擴(kuò)增

取東亞飛蝗成蟲(chóng)1只，迅速解剖去內(nèi)臟后用液氮冷凍組織，用TRIZOL法提取總RNA.RNA經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)其完整性以及是否有基因組DNA污染；經(jīng)分光光度計(jì)測(cè)定其濃度.使用TransScriptTMFirst－Strand cDNA Synthesis SuperMix（TransGen）對(duì)RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲取cDNA.

根據(jù)已提交的LmiHc1基因核苷酸序列（GenBank：HQ213937），用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增LmiHc1部分基因的一對(duì)特異性引物F和R，F(xiàn)：5'－CGGCCTACAAGGCCAAGATGAG－3'（下劃線為BamHⅠ酶切位點(diǎn)）R：5'－CCTTACACCTGCACCTCCTCGA－3'（下劃線為HindⅢ酶切位點(diǎn)）.引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成.PCR擴(kuò)增預(yù)計(jì)總長(zhǎng)度為750bp.以東亞飛蝗cDNA為模板，F(xiàn)，R為引物擴(kuò)增LmiHc1部分基因.PCR程序：94℃預(yù)變性3min；PCR擴(kuò)增：94℃變性30s，65℃退火30s，72℃延伸1min，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃終末延伸10min.10g／L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所擴(kuò)增片段的正確性，膠回收試劑盒回收目的片段.

1.2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

用試劑盒TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.2.0小量提取質(zhì)粒pET－DsbA.質(zhì)粒pETDsbA和目的基因經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切，回收酶切片段，T4連接酶試劑盒作用下25℃連接2h，轉(zhuǎn)化宿主菌，雙酶切鑒定篩選出陽(yáng)性克隆.挑取陽(yáng)性克隆接種到LA（含100μg／mL氨芐青霉素）液體培養(yǎng)基中，大量增菌后，送往深圳華大基因科技有限公司測(cè)序.

1.2.3 pET－DsbA／LmiHc1融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

將測(cè)序正確的陽(yáng)性重組子質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌E.coliBL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞.篩選轉(zhuǎn)化入重組質(zhì)粒的表達(dá)宿主菌，將其接種于LB／Amp＋培養(yǎng)基中，37℃過(guò)夜震蕩培養(yǎng)，然后取1mL過(guò)夜培養(yǎng)物接種于新培養(yǎng)基中，37℃220r／min繼續(xù)培養(yǎng)至OD600≈0.6時(shí)，取1mL菌液于Eppendorf管中，離心棄上清液，收集菌體作為空誘導(dǎo)對(duì)照.在剩下的菌液中加入IPTG至終濃度為1mmol／L，誘導(dǎo)3h，然后取1mL，離心棄上清液收集菌體沉淀，同時(shí)取空載pET－DsbA菌作為陰性對(duì)照.向沉淀中加入100μL 2×SDS上樣緩沖液，混勻后沸水浴10min，各取5μL進(jìn)行質(zhì)量濃度為100g／L的SDS－PAGE電泳以檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)情況.

2 結(jié)果與分析

2.1 LmiHc1目的基因PCR的擴(kuò)增

對(duì)東亞飛蝗cDNA片段進(jìn)行RT－PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物于10g／L瓊脂糖凝膠電泳，約750bp處可見(jiàn)明亮的特異帶，與預(yù)期條帶大小相符，結(jié)果見(jiàn)圖1.

2.2 LmiHc1基因及質(zhì)粒雙酶切純化回收

pET－DsbA質(zhì)粒與LmiHc1PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別用BamHⅠ、HindⅢ雙酶切，切膠回收后，經(jīng)過(guò)10g／L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，條帶大小正確，且呈現(xiàn)單一條帶，說(shuō)明雙酶切完全.

2.3 重組質(zhì)粒鑒定

隨機(jī)挑取6個(gè)重組轉(zhuǎn)化的單菌落進(jìn)行質(zhì)粒提取，經(jīng)過(guò)BamHⅠ、HindⅢ雙酶切后電泳檢測(cè)，重組質(zhì)粒鑒定后都有750bp左右的目的片段，證明pET－DsbA／LmiHc1原核表達(dá)載體構(gòu)建成功，選取1個(gè)質(zhì)粒送測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序.

圖1 LmiHc1PCR產(chǎn)物Fig.1 PCR product of LmiHc1

2.4 重組融合蛋白LmiHc1的誘導(dǎo)表達(dá)

pET－DsbA／LmiHc1轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌BL21（DE3），經(jīng)過(guò)IPTG誘導(dǎo)后，收集菌體沉淀經(jīng)質(zhì)量濃度為100g／L的SDS－PAGE電泳檢測(cè)，結(jié)果可見(jiàn)相對(duì)分子質(zhì)量25ku處有1條明顯的蛋白條帶，與預(yù)計(jì)的融合蛋白分子質(zhì)量大小基本相符，同時(shí)作為對(duì)照組的pET－DsbA空載體也表達(dá)了分子質(zhì)量約25ku的DsbA蛋白，電泳結(jié)果如圖2所示.

3 Lmi Hc1蛋白的結(jié)構(gòu)分析

通過(guò)前期工作獲得LmiHc1的cDNA完整序列（GenBank：HQ213937）的分析［15］，LmiHc1基因全長(zhǎng)為2271bp，包含1個(gè)2016bp的完整開(kāi)放閱讀框ORF和1個(gè)255bp 3'－UTR，PolyA尾上游15個(gè)核苷酸處存在典型的加尾信號(hào)AATAAA.

圖2 大腸桿菌BL21（DE3）表達(dá)LmiHc1重組蛋白的SDS－PAGE分析Fig.2 SDS－PAGE analysis of LmiHc1expression of recombinant protein in E.coli BL21（DE3）

3.1 LmiHc1蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)分析

蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)（primary structure）是指多肽鏈的氨基酸殘基的排列順序，它是蛋白質(zhì)最基本的結(jié)構(gòu).每一種蛋白質(zhì)分子都有其特有的氨基酸組成和排列順序，由此決定它的特定空間結(jié)構(gòu).

利用Signal P 3.0軟件分析表明，LmiHc1基因編碼的蛋白質(zhì)N端有18個(gè)氨基酸的信號(hào)肽，成熟蛋白質(zhì)含有654個(gè)氨基酸，理論分子質(zhì)量為77.9ku，理論P(yáng)I為6.06，負(fù)電荷殘基（Asp＋Glu）94個(gè)（14.0%），正電荷殘基（Arg＋Lys）82個(gè)（12.2%），疏水性氨基酸（A，I，L，F(xiàn)，W，V）有232個(gè)，約占34.5%；極性氨基酸（N，C，Q，S，T，Y）150個(gè)，占22.3%；在體外哺乳動(dòng)物網(wǎng)狀細(xì)胞中的估計(jì)半衰期為30h，在體外有機(jī)體內(nèi)的半衰期大于20h，在大腸桿菌內(nèi)的半衰期大于10h，蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)為44.82，屬于不穩(wěn)定蛋白（不穩(wěn)定系數(shù)大于40的為不穩(wěn)定蛋白質(zhì)）；疏水性指數(shù)為82.93.

3.2 LmiHc1蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)（secondary structure）是指氨基酸殘基形成的α螺旋（α－h(huán)elix）、β折疊（β－sheet）、無(wú)規(guī)則卷曲（coil）以及基序（motif）等組件.

采用SABLE（http：／／sable.cchmc.org／）在線工具預(yù)測(cè)東亞飛蝗LmiHc1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)（圖3）.結(jié)果顯示，LmiHc1蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)為混合型，由α螺旋、β折疊與無(wú)規(guī)則卷曲組成.

3.3 LmiHc1蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

基于查詢序列與已知蛋白序列顯著的相似性（相似度＞30%）預(yù)測(cè)其蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的方法稱為同源建模.Swiss－Model是通過(guò)完整的同源建模預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的在線工具.其基本操作步驟如下：首先同源鑒定，Swiss－Model程序使用BLAST在PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出符合P值小于10－5（BLAST）及靶序列一致性不小于30%（SLM）的模板序列用于建模；然后，對(duì)所得的多模板進(jìn)行結(jié)構(gòu)比對(duì)，剔除不匹配模板；再根據(jù)模板序列與靶序列的局部一致性原理，由ProModⅡ確定其核心骨架以及環(huán)和側(cè)鏈；最后用Gromos程序進(jìn)一步優(yōu)化能量.

采用Swiss－Model上提供的第1步模式（First Approach Mode）對(duì)LmiHc1蛋白序列進(jìn)行建模（圖4）.提交序列后返回結(jié)果顯示：建模為24～669個(gè)氨基酸，參考模板為1hcyC，目標(biāo)蛋白與參考蛋白的序列比對(duì)的一致性為43.19%，模型評(píng)估E值為0.00e－1.

圖3 預(yù)測(cè)LmiHc1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.3 Secondary structure of LmiHc1

圖4 預(yù)測(cè)東亞飛蝗LmiHc1蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.4 Tertiary structure of LmiHc1

利用NCBI的CD search分析血藍(lán)蛋白的結(jié)構(gòu)域（圖5），其中Query seq為L(zhǎng)miHc1氨基酸序列，Specific hits指特異性位點(diǎn)，Superfamilies指節(jié)肢動(dòng)物血藍(lán)蛋白超家族.結(jié)果顯示LmiHc1含有節(jié)肢動(dòng)物血藍(lán)蛋白家族蛋白所具有的3個(gè)結(jié)構(gòu)域：Hemocyanin＿N，Hemocyanin＿M(jìn)，Hemocyanin＿C.其中Hemocyanin＿M(jìn)為結(jié)合銅離子的結(jié)構(gòu)域.

圖5 LmiHc1蛋白結(jié)構(gòu)域分析Fig.5 LmiHc1protein domain analysis

4 討論

血藍(lán)蛋白作為3大類呼吸功能蛋白之一，不僅承擔(dān)著氧氣傳輸?shù)墓δ埽疫€具備能量?jī)?chǔ)存和免疫防御等功能，血藍(lán)蛋白不僅在實(shí)驗(yàn)中顯示出酚氧化酶活性，甚至可以轉(zhuǎn)化為酚氧化酶；此外，血藍(lán)蛋白可以介導(dǎo)蛻皮激素在血淋巴中的轉(zhuǎn)運(yùn)并參與調(diào)節(jié)蛻皮.近年來(lái)，血藍(lán)蛋白的功能、作用機(jī)理、進(jìn)化地位已經(jīng)引起各國(guó)學(xué)者的濃厚興趣，血藍(lán)蛋白的新功能及其作用機(jī)理仍有待于進(jìn)一步挖掘和深究.東亞飛蝗Locustamigratoria manilensis是中國(guó)飛蝗的3個(gè)亞種之一，中國(guó)史籍中的蝗災(zāi)，主要是東亞飛蝗，先后發(fā)生過(guò)800多次，分布于北緯42℃以南的東部季風(fēng)區(qū)的平原地區(qū)，北起河北、陜西、山西，南達(dá)海南、廣東、廣西、云南，東至沿海各省及臺(tái)灣，西至四川、甘肅南部［15］.為了研究東亞飛蝗血藍(lán)蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，本文對(duì)東亞飛蝗血藍(lán)蛋白亞基1插入合適的載體后導(dǎo)入大腸桿菌進(jìn)行重組蛋白表達(dá)，并對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測(cè)，結(jié)果LmiHc1可以在大腸桿菌中正常表達(dá)，為進(jìn)一步研究其蛋白結(jié)構(gòu)和功能打下了基礎(chǔ)，進(jìn)而為害蟲(chóng)的生物防治以及昆蟲(chóng)資源的開(kāi)發(fā)利用奠定理論基礎(chǔ).

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