何 玲，唐滿華，梁桂益，陳瑞愛(ài)，2

(1．廣東大華農(nóng)動(dòng)物保健品股份有限公司，廣東新興 527400;2．華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣州 510642)

豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)為豬的常見(jiàn)易感病毒之一，對(duì)哺乳仔豬的危害最嚴(yán)重，感染后死亡率可達(dá)100%。我國(guó)以12月至次年2月為本病高發(fā)季節(jié)［1］，并多與豬傳染性胃腸炎、輪狀病毒等其他腸道病原混合感染，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失［2］。PEDV適應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)難度高，人工細(xì)胞培養(yǎng)很難獲得成功。Hoffman等在Vero細(xì)胞的培養(yǎng)液中加入胰酶，才使得PEDV的細(xì)胞培養(yǎng)首次獲得成功［3］，之后陸續(xù)有PEDV在Vero細(xì)胞中獲得成功培養(yǎng)的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)將豬流行性腹瀉病毒疑似病豬的糞便樣品處理后在Vero細(xì)胞上連續(xù)傳代，分離到一株豬流行性腹瀉病毒，命名為ShT株，并對(duì)該病毒的培養(yǎng)特性、繁殖滴度進(jìn)行了研究。

1 材料

1．1 病料 待檢樣品為糞便樣，來(lái)自廣東省某豬場(chǎng)疑似發(fā)生豬流行性腹瀉的病豬。發(fā)病仔豬臨床表現(xiàn)水樣腹瀉;死亡豬小腸段充滿黃色液體，腸壁變薄。

1．2 細(xì)胞及培養(yǎng)試劑 Vero細(xì)胞由廣東大華農(nóng)公司技術(shù)中心生藥研發(fā)室保存;胎牛血清、DMEM營(yíng)養(yǎng)液購(gòu)自 Hyclone公司，批號(hào)分別為 GWH0092，NXK0731;胰蛋白酶購(gòu)自 GIBCO公司，批號(hào)為894452。

1．3 病毒鑒定引物 根據(jù)GenBank報(bào)告的PEDV N基因cDNA序列(accession NC003436)，設(shè)計(jì)2對(duì)引物，分別為套式PCR的外圍引物和內(nèi)圍引物，擴(kuò)增的目的片段長(zhǎng)度分別為467 bp和221 bp。外圍引物序列為:P1:5’－TATGTCTAACGGTTCTATTCCC－3’;P2:5`－CCTTATAGCCCTCTACAAGCA －3’;內(nèi)圍引物序列為:P3:5’－GGGCTAGCTTCCAGGTCAAC －3’，P4:5’－ CGTTACACCAGTTGGTGCTC－3’。引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。

1．4 其他主要試劑 膠體金試紙卡Anigen Rapid PEDV Ag test Kit(RG14－01)由韓國(guó)BioNote公司生產(chǎn)。

PEDV與豬細(xì)小病毒(PPV)特異性陽(yáng)性血清:由廣東大華農(nóng)公司技術(shù)中心生藥研發(fā)室制備并保存。

MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit(DV819A)、PrimeScript One Step RT －PCR Kit(DRR055A)、pMD20 － T Vector(D107A)、Premix Taq(D334)等購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司;Gel Extraction Kit(DC3511－01)為Biomiga公司產(chǎn)品。RT－PCR反應(yīng)總體積25μL，包含PrimeScript One Step enzymemix 1μL、2 × One Step Buffer 12．5 μL、RNA模板2μL，上下游引物(濃度為10μm/L)各2μL，滅菌水5．5μL。套式 PCR反應(yīng)總體積25μL，包含 Premix Taq 12．5 μL，模板2 μL，上下游引物(濃度為10 μm/L)各2μL，滅菌水6．5 μL。

2 方法

2．1 病料的PCR檢測(cè) 取待檢糞樣，4℃8000 g離心15 min，收集上清液;再用4層紗布過(guò)濾，收集濾出液，－70℃保存。采用氯仿－異戊醇方法提取病毒RNA，用設(shè)計(jì)的豬流行性腹瀉病毒的外圍引物按常規(guī)方法檢測(cè)PEDV N基因，擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s，53 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸30s，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。

2．2 病毒的分離 經(jīng)PCR檢測(cè)為PEDV陽(yáng)性的樣品12000 g離心10 min，取上清液以0．22μm無(wú)菌濾膜將含病毒的上清液過(guò)濾除菌。取24 h生長(zhǎng)良好的Vero單層細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，按照10%接毒劑量接入上清液，即10 mL DMEM營(yíng)養(yǎng)液中加入100μL病毒液。參考以往報(bào)道的文獻(xiàn)資料添加胰酶至終濃度為0～60μg/mL。設(shè)置不接種病毒的含有相同濃度胰酶的細(xì)胞培養(yǎng)物作為陰性對(duì)照，置37℃5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)，逐日觀察，以48～96 h為一個(gè)傳代周期，盲傳3～4代。

2．3 細(xì)胞分離物的檢測(cè)

2．3．1 套式PCR檢測(cè)及序列測(cè)定 細(xì)胞培養(yǎng)物反復(fù)凍融3次后，采用氯仿－異戊醇方法提取病毒RNA，用外圍引物按2．1的方法擴(kuò)增豬流行性腹瀉病毒的N基因。PCR產(chǎn)物1∶100稀釋后，再用內(nèi)圍引物進(jìn)行套式PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s，54℃復(fù)性 30 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸7 min。將套式PCR擴(kuò)增片段插入pMD－18T simple vector中，進(jìn)行序列測(cè)定。將測(cè)序結(jié)果與GeneBank中公布的PEDV N基因核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)。

2．3．2 膠體金試紙卡檢測(cè) 用韓國(guó)Anigen Rapid PEDV Ag test Kit檢測(cè)。取培養(yǎng)至第27代和37代的病毒液100μL，加入裝有1 mL反應(yīng)緩沖液的樣品收集管中，充分混勻;取出膠體金試紙卡，平放于寬敞和干燥的表面;用滴管向樣品孔中緩慢并且精確地加入4－5滴混和液;反應(yīng)進(jìn)行時(shí)，會(huì)有紫色的條帶在試紙中間的窗口中移動(dòng);5～10 min判斷結(jié)果。

2．3．3 血清中和試驗(yàn) 采用固定病毒量稀釋血清的方法。PEDV和PPV陽(yáng)性血清由本實(shí)驗(yàn)室制備保存。PPV陽(yáng)性血清作為陰性對(duì)照，DMEM液作為空白對(duì)照。

2．4 PEDV的培養(yǎng)特性

2．4．1 病毒的傳代培養(yǎng) 將上一代的細(xì)胞培養(yǎng)物反復(fù)凍融3次，按2．2所述進(jìn)行傳代。整個(gè)傳代過(guò)程期間，設(shè)置不接種病毒的含有相同濃度胰酶的細(xì)胞培養(yǎng)物作為陰性對(duì)照，逐日觀察細(xì)胞病變效應(yīng)。待出現(xiàn)明顯病變時(shí)，按出現(xiàn)病變最早，最明顯的培養(yǎng)條件繼續(xù)傳代。

2．4．2 病毒致細(xì)胞病變效應(yīng)的特性 在倒置顯微鏡下觀察并記錄PEDV在Vero細(xì)胞上的CPE形成情況。

2．4．3 病毒的細(xì)胞感染滴度測(cè)定 在96孔細(xì)胞板上進(jìn)行，每個(gè)稀釋度接種8孔，每孔0．1mL，病毒稀釋液為含有100μg/mL卡那霉素的DMEM。置37℃5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)，逐日觀察。根據(jù)細(xì)胞病變孔數(shù)按Reed－Muench法計(jì)算TCID50/0．1 mL。

3 結(jié)果

3．1 從糞便樣和細(xì)胞培養(yǎng)物中擴(kuò)增PEDV N基因的結(jié)果 對(duì)糞便樣品進(jìn)行RT－PCR檢測(cè)，結(jié)果擴(kuò)增出1條約為460 bp的DNA片段，其大小與預(yù)計(jì)片段理論值相符(如圖1－A)。第8代病毒液用套式PCR擴(kuò)增出1條約為220 bp的DNA片段，其大小與預(yù)計(jì)片段理論值相符(如圖1－B)。分別將糞便樣品的擴(kuò)增片段和病毒液的套式PCR擴(kuò)增片段插入pMD－20T vector中，進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與GenBank中已公布的PEDV(accession NC003436)N基因核苷酸序列相似度達(dá)99%以上。

圖1 PEDV PCR鑒定結(jié)果

3．2 膠體金試紙卡檢測(cè) 培養(yǎng)至第27代和37代的病毒液10倍稀釋后滴入試紙卡的樣品孔中，質(zhì)控線(C線)出現(xiàn)紫色條帶，檢測(cè)線(T線)出現(xiàn)淡淡的紫色條帶，表明病毒液中含有PEDV，且其毒價(jià)不低于104TCID50/0．1 mL，因?yàn)榇嗽嚰埧ǖ臋z測(cè)靈敏度為 104TCID50/0．1 mL。

3．3 血清中和試驗(yàn) 血清中和試驗(yàn)表明分離獲得的病毒能被PEDV陽(yáng)性血清中和，而不能被PPV陽(yáng)性血清中和。進(jìn)一步證實(shí)Vero細(xì)胞分離物中存在PEDV，命名為PEDV ShT株。

3．4 病毒的細(xì)胞培養(yǎng)特性 盲傳至第4代時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞病變，第5代病變已非常明顯，以后隨著傳代次數(shù)的增加，CPE逐漸增加，并且出現(xiàn)的時(shí)間縮短，表現(xiàn)為細(xì)胞腫脹、變圓，顆粒物質(zhì)增多，折光性增強(qiáng)和培養(yǎng)后期細(xì)胞的大量脫落(如圖2)。

圖2 接種PEDV的Vero細(xì)胞產(chǎn)生的病變

3．5 病毒的細(xì)胞感染滴度 取用Vero細(xì)胞培養(yǎng)至第20代，25代、30代的病毒液，測(cè)其細(xì)胞感染滴度，病毒稀釋液為含有100μg/mL卡那霉素的DMEM。結(jié)果，其 TCID50/0．1 mL 分別為 10－7．0、10－7．13、10－7．33。

4 討論

國(guó)內(nèi)有關(guān)豬流行性腹瀉病毒分離鑒定的報(bào)道不少［4－5］，但是病毒的分離條件、培養(yǎng)增殖條件不盡相同。例如，錢(qián)永清等［6］將病毒在 Vero細(xì)胞上盲傳5代后，轉(zhuǎn)入Marc145細(xì)胞上培養(yǎng)，維持液為含一定胰酶的1640培養(yǎng)液，盲傳至第7代出現(xiàn)細(xì)胞病變。本試驗(yàn)采用Vero細(xì)胞、含胰酶的DMEM分離到一株豬流行性腹瀉病毒(PEDV ShT株)。病毒盲傳第4代時(shí)就觀察到細(xì)胞病變，表現(xiàn)為細(xì)胞腫脹變圓，折光性增加，顆粒物質(zhì)增多，培養(yǎng)后期出現(xiàn)細(xì)胞的大量脫落。

用含胰酶和不含胰酶的DMEM作為稀釋液測(cè)PEDV ShT株的細(xì)胞感染滴度，兩者獲得的結(jié)果相差甚遠(yuǎn)。因此，認(rèn)為PEDV的細(xì)胞培養(yǎng)物毒價(jià)的比較和評(píng)定不能單純比較數(shù)值多少，還應(yīng)清楚取得該數(shù)值的測(cè)定方法與條件。另外還可以借助膠體金檢測(cè)卡、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等方法來(lái)輔助評(píng)價(jià)病毒細(xì)胞培養(yǎng)物毒價(jià)的高低。

PEDV的體外細(xì)胞適應(yīng)難度大，繁殖條件復(fù)雜，病毒在細(xì)胞培養(yǎng)中繁殖滴度低，一直是PEDV體外增殖過(guò)程的一個(gè)重要技術(shù)瓶頸，直接影響了PEDV的生物學(xué)特性基礎(chǔ)研究和實(shí)踐中相關(guān)生物制品的發(fā)展［7］。研究中的PEDV ShT株能在Vero細(xì)胞上穩(wěn)定生長(zhǎng)，產(chǎn)生的病變也十分明顯。結(jié)合PEDV ShT株病料來(lái)源的感染豬的臨床癥狀及其細(xì)胞培養(yǎng)特性來(lái)看，其很有希望成為一較好的疫苗株。但是其能否真正成為豬流行性腹瀉病毒疫苗的種毒候選株，還需要后續(xù)對(duì)其免疫原性和穩(wěn)定性進(jìn)行試驗(yàn)研究。

［1］ 殷 震，劉景華．動(dòng)物病毒學(xué)(第二版)［M］．北京:科學(xué)出版社．1996:688－690．

［2］ 倪艷秀，林繼煌，何孔旺，等．豬流行性腹瀉研究概況［J］．畜牧與獸醫(yī)，2001，33(1):38 －40．

［3］ Hofmann M，Wyler R．Propagation of the virusof porcine epidemic diarrhea in cell culture［J］．JClin Microbiol，1988，26:2235 －2239．

［4］ 張桂紅．豬流行性腹瀉病毒地方株LJB/03株分離鑒定［D］．黑龍江哈爾濱:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008．

［5］ 錢(qián)永清，聞人楚，唐永蘭，等．豬流行性腹瀉病毒的分離培養(yǎng)與鑒定［J］．上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，1999，15(2):41 －44．

［6］ 錢(qián)永清，蘇萬(wàn)國(guó)，何錫忠，等．從上海郊區(qū)新分離到一株豬流行性腹瀉病毒［J］．上海畜牧獸醫(yī)通訊，2003，6:15．

［7］ 毛雅元，張桂紅，葛俊偉，等．豬流行性腹瀉病毒地方株LJB/03株分離及培養(yǎng)特性［J］．病毒學(xué)報(bào)，2010，26(6):483－488．