孫 博，李繼昌，王小飛，王鳳霞，覃曉林，孫美成，代重山

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030)

慢呼抗口服液是由黃芩、金銀花、百部、紫菀、甘草五味中藥組成的中藥復(fù)方制劑，主要用于治療雞毒支原體病，具有扶正祛邪、殺菌、清熱解毒、潤肺止咳、增強機體免疫力等功效［1］。黃芩與金銀花在方劑中是關(guān)鍵組分，二者的主要成分分別為黃芩苷和綠原酸。目前，慢呼抗口服液的藥代動力學(xué)研究尚不明確，缺乏可靠的藥理學(xué)研究數(shù)據(jù)，限制了慢呼抗口服液在臨床中的應(yīng)用。由于高效液相色譜法(HPLC)檢測技術(shù)在藥代動力學(xué)研究中已經(jīng)成熟，分析技術(shù)及實驗方案的合理性對最終目標會產(chǎn)生相應(yīng)影響，并且使用內(nèi)標法同時測定多味中藥的兩種成分還不常見，故本文建立HPLC法測定慢呼抗口服液中黃芩苷和綠原酸在雞血漿中的濃度，以期為藥代動力學(xué)研究提供參考。

1 材料

1．1 儀器 Waters高效液相色譜儀、Kromasil C18色譜柱(4．6 mm ×150 mm，5μm)、Nova－Pak C18 Guard－PakTM保護柱、SPD－10AVP紫外檢測器、離心機、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、超聲儀、電熱恒溫水浴鍋、分析天平、超聲清洗儀、漩渦混合器、真空干燥箱、微孔濾膜、注射器。

1．2 藥品及配制

1．2．1 藥品 對照品黃芩苷(Baicalin，BC，批號MUST－11101403)、對照品綠原酸(Chlorogenic acid，ChA，批號 MUST －11042802)、內(nèi)標物葛根素(Puerarin，Pr)、色譜甲醇、色譜乙腈、超純水，其他試劑均為分析純，中藥復(fù)方制劑自制。

1．2．2 試劑的配制 對照品溶液的制備:分別精密稱取對照品黃芩苷及綠原酸各2 mg，用色譜甲醇定容于同一個10 mL容量瓶中，經(jīng)超聲處理20 min后取出，放至室溫，加流動相至刻度，搖勻，高速離心(3000 r/min)取上清，4℃冰箱保存待用，使用前稀釋成相應(yīng)濃度。取內(nèi)標物葛根素2 mg，用色譜甲醇定容于10 mL容量瓶中，處理方法同上。慢呼抗口服液的制備:黃芩、金銀花、百部、紫菀、甘草五味中藥按照質(zhì)量比為3∶2∶2∶2∶1的比例水提醇沉，60℃旋蒸至100mL藥液，含生藥量為1 g/mL，4℃冰箱保存。

1．3 實驗動物 海蘭雛雞5只，1日齡購入，雌雄兼有，籠養(yǎng)，自由采食、飲水。臨床上無疾病癥狀，飼養(yǎng)期間溫度控制在(25±2)℃，自由采食及飲水，飼料為普通全價日糧。至4周齡時進行試驗。

1．4 空白血漿制備 翅下靜脈取血約10mL，放入肝素化的離心管中，3000 r/min離心10 min，分離血漿，取上清，放置－20℃冰箱備用。

2 方法與結(jié)果

2．1 色譜條件的建立 流動相A相:乙腈、甲醇，B相:1%冰醋酸、10%磷酸;檢測波長根據(jù)《中華人民共和國藥典》選擇，黃芩苷和綠原酸檢測波長分別為280、327 nm［2］。色譜條件如表1。柱溫25℃;進樣量10μL。如圖1，峰形良好，各成分能完全分離。

2．2 血漿樣品處理方法 分別配制濃度為4、50、160μg/mL和2、40、150μg/mL的黃芩苷及綠原酸混合對照品溶液，每個濃度平行操作5次［3］。放入40℃真空干燥箱，殘渣加入300μL空白血漿，加入內(nèi)標物50μL，漩渦1 min。加入以下三種溶液800 μL，1、高氯酸;2、V(甲醇)∶V(乙腈)=3 ∶1;3、正丁醇;漩渦1min，離心(3000 r/min)，前兩者分別取上清800μL于干凈EP管中，55℃真空干燥;正丁醇處理后取醇層，減壓回收。殘渣分別加入200 μL流動相，漩渦1 min，超聲10 min，過0．22 μm微孔濾膜，10μL進樣［4］。以上三種方法為高氯酸法、甲醇乙腈法、正丁醇法。提取回收率結(jié)果見表2。由表2可知，甲醇乙腈法測得黃芩苷的平均回收率為84．8%，RSD值＜4．8;綠原酸的平均回收率為85．9%，RSD值＜4．3%，并且用正丁醇法處理各個峰的分離度較差，因此，甲醇乙腈法處理血漿簡單、快捷，為最佳提取方法。

表1 流動相梯度變化程序表

表2 黃芩苷及綠原酸在雞血漿中提取回收率(n=5)

2．3 血漿處理方法學(xué)考察

2．3．1 專屬性考察 慢呼抗口服液進樣后色譜圖1;取300μL空白血漿，按照2．2項甲醇乙腈法處理后的色譜圖2;空白血漿添加標準品按照2．2項甲醇乙腈法處理后的色譜圖3;取給藥后血漿樣品，按照2．2項甲醇乙腈法處理后的色譜圖4。結(jié)果表明，黃芩苷、葛根素、綠原酸的保留時間分別為10．2、12．6、24．0 min。內(nèi)標物葛根素及待測物黃芩苷、綠原酸完全分離，峰形良好，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不會干擾樣品的測定。

2．3．2 標準曲線 分別配制 0．1、2、10、50、80、160 μg/mL濃度的黃芩苷、綠原酸標準溶液。分別加入濃度為10 mg/mL的內(nèi)標溶液50μL，55℃真空干燥。殘渣加入0．3 mL空白血漿，按照2．2項下甲醇乙腈法處理后，取10μL進樣［5］。記錄色譜圖，計算黃芩苷峰面積A1、綠原酸峰面積A2和內(nèi)標峰面積AIS的比值得相應(yīng)回歸方程(Y=A/AIS)，Y1=0．6724x+0．1793，R=0．999;Y2=0．1725x+0．0551，R=0．9997。黃芩苷及綠原酸方法最低檢測限分別為0．12、0．2 μg/mL。

2．3．3 精密度及準確度測定 分別配制濃度為4、50、160 μg/mL 和2、40、150 μg/mL 的黃芩苷及綠原酸血漿樣品。按所建立的方法平行操作5次;按所建立的方法，每天一次，連續(xù)5 d。分別求出對照品與內(nèi)標物峰面積比，代入各自的標準曲線得出相應(yīng)濃度，求出日內(nèi)、日間精密度及相對回收率和準確度［6］。由表3可知黃芩苷與綠原酸日內(nèi)精密度均＜5%，日間精密度＜9%，說明血漿樣品分析方法精密度和準確度良好，符合有關(guān)規(guī)范要求。

表3 黃芩苷及綠原酸在雞血漿中精密度和準確度(n=5)

2．3．4 穩(wěn)定性測定 取對照品及內(nèi)標物，反復(fù)進樣5次，考察儀器穩(wěn)定性，得黃芩苷、綠原酸、葛根素含量RSD 分別為1．6%、1．2%和1．5%;取血漿樣品濃度為50μg/mL的黃芩苷及綠原酸混合溶液，按 2．2 項中甲醇乙腈法處理，與 0、2、4、6、12、18、24 h分析測定血漿中藥物含量，考察室溫放置24 h樣品的穩(wěn)定性，得黃芩苷和綠原酸含量RSD分別為1．8%和2．0%;取血漿樣品濃度為50μg/mL的黃芩苷及綠原酸混合溶液，反復(fù)凍融3個循環(huán)測定血漿樣品從－20℃至室溫的凍融穩(wěn)定性，黃芩苷和綠原酸含量RSD分別為7．2%和5．0%。

3 討論

3．1內(nèi)標物選擇及HPLC方法建立 內(nèi)標法能減小誤差，使結(jié)果更準確。中藥復(fù)方成分比較復(fù)雜，因此在選擇內(nèi)標物時，要避免與復(fù)方中其他成分及血漿中內(nèi)源性物質(zhì)峰型相互干擾［7］。根據(jù)黃芩苷及綠原酸的結(jié)構(gòu)，選擇結(jié)構(gòu)式相近化合物并結(jié)合HPLC預(yù)試來篩選。蘆丁出峰時間為18．2 min，與復(fù)方中成分峰重疊，因此選擇葛根素作為內(nèi)標物。流動相選用甲醇時，色譜峰拖尾，并且成分不能完全分離，故流動相選用乙腈。經(jīng)過預(yù)試，梯度洗脫時間在A:5%(0 min)～37%(30 min)，峰形良好，分離完全，對有效成分測定無干擾。

3．2 血漿處理方法 藥代動力學(xué)血漿樣品的預(yù)處理，一般用蛋白沉淀或萃取的方法。除去血漿中蛋白有多種試劑可供選擇，但在處理樣品之前應(yīng)了解該方法是否會導(dǎo)致生物樣品中的藥物發(fā)生分解或影響藥物提取率以及破壞藥物酸堿性等。加入高氯酸可使蛋白質(zhì)形成不溶性鹽而析出，甲醇、乙腈是沉淀蛋白常用有機溶劑，黃芩苷和綠原酸都含有羥基和羧基，呈弱酸性，極性較大，因此，在除蛋白的過程中要防止使用堿性溶液或被空氣氧化。在沉淀蛋白前充分漩渦或離心，以防止提取藥物被蛋白包裹。

3．3 血漿處理方法學(xué)考察 通過對甲醇乙腈法專屬性、加樣回收率、線性關(guān)系、精密度、準確度及穩(wěn)定性的考察可以看出，該檢測方法及處理方法可以作為中藥復(fù)方慢呼抗口服液的藥代動力學(xué)研究方法，并且對該藥物的進一步研究具有指導(dǎo)意義。

［1］ 陳少萍．綠原酸藥代動力學(xué)研究進展［J］．中成藥，2010，32(4):645－648．

［2］ 中華人民共和國國家藥典委員會．中國藥典一部［M］．北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:598－599．

［3］ 肖崇厚．中藥化學(xué)［M］．上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出社，1987:327－328．

［4］ 孫麗榮，嚴華成，曹 雄，等．不同血漿樣品制備方法對芍藥苷血液藥物濃度測定的影響［J］．中國藥物與臨床，2008，8(11):846－848．

［5］ 居文政，劉 芳，吳 婷，等．UPLC－MS/MS法同時測定人血漿中黃芩苷和綠原酸［J］．藥學(xué)學(xué)報，2007，42(10):1074－1077．

［6］ 高 榮．銀黃注射液和銀黃口服液在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)－藥效學(xué)研究和代謝組學(xué)初步研究［D］．成都:四川大學(xué)，2007．

［7］ Natalie L．Use of fingerprinting and compounds for identification and standardization of botanical drugs:strategies for applying pharmaceutical HPLC analysis to herbal products［J］．Drug Inf J，1998，32(4):497 －512．