趙萱，傅超美，徐曉秋，游宇

滋陰活血利咽顆粒是由丹參、玄參、麥冬、黃連、牛蒡子、余甘子、桔梗、蟬蛻等中藥組成的復(fù)方制劑，具有滋陰潤(rùn)燥、活血化瘀、解毒利咽的功效，用于治療陰虛血瘀、邪毒滯留所致咽喉干燥、咽痛不適、咽內(nèi)異物感的慢性咽炎[1]。為保證該藥的用藥質(zhì)量，本試驗(yàn)采用高效液相色譜法測(cè)定制劑中丹參素鈉的含量并進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證，采用薄層色譜法對(duì)制劑中丹參、赤芍、黃連、牛蒡子及玄參進(jìn)行了鑒別，所建立的方法簡(jiǎn)便、可靠、重復(fù)性好，可用于該制劑的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

Agilent 1200型高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；DiamonsilTM C18色譜柱（150×4.6 mm,5μm,美國(guó)迪馬公司）；Sartorius-BS110S分析天平（德國(guó)賽多利斯公司）；AS10200A超聲波清洗器（南京昕航科學(xué)儀器有限公司）；

丹參素鈉對(duì)照品（批號(hào)：810-200004）、芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)0715-200211）、鹽酸小檗堿對(duì)照品(批號(hào):110713-200208）、丹參對(duì)照藥材(批號(hào)： 0766-200417)、黃連對(duì)照藥材 ( 批號(hào): 120913-200407)、牛蒡子對(duì)照藥材（批號(hào)： 0819 - 9802 )、玄參對(duì)照藥材（批號(hào)：121008-200505），均購(gòu)于四川省藥品檢驗(yàn)所，中國(guó)藥品生物制品檢驗(yàn)所提供。糊精、蛋白糖為藥用規(guī)格。甲醇為色譜純?cè)噭疄橹卣麴s水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 丹參的薄層鑒別 稱取顆粒10 g，研細(xì)，加水50 mL，加鹽酸調(diào)節(jié)pH值至1，用乙酸乙酯振搖提取兩次，每次加入25 mL，合并提取液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液；稱取丹參對(duì)照藥材2 g，加水200 mL，煎煮1.5小時(shí)，濾過(guò)，濾液濃縮至40mL，放冷，用乙酸乙酯振搖提取兩次，每次加入25 mL，合并提取液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為對(duì)照藥材溶液；取丹參素鈉對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液；稱取10 g陰性顆粒按供試品溶液的制備方法制備成陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄Ⅵ B)試驗(yàn)，吸取上述四種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，用甲苯-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(2:3:4:0.5:2)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以2%三氯化鐵乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，而陰性無(wú)干擾。見(jiàn)圖1。

圖1 .丹參的薄層鑒別

2.1.2 赤芍的薄層鑒別 稱取顆粒10 g，加入飽和正丁醇20 mL振搖提取，正丁醇溶液加氨試液洗滌2次，每次加入10 mL，棄去氨試液，將正丁醇溶液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液；稱取赤芍對(duì)照藥材0.5 g，加乙醇10 mL，振搖5分鐘，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)? mL乙醇使溶解，作為對(duì)照藥材溶液；取芍藥苷對(duì)照品，加乙醇制成每1 mL含2 mg的溶液，做為對(duì)照品溶液；稱取10 g陰性顆粒按供試品溶液的制備方法制備成陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取上述四種溶液5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-甲酸-冰醋酸-水(15:0.5:1:1:2)為展開(kāi)劑展開(kāi)，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品、對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，而陰性無(wú)干擾。見(jiàn)圖2。

圖2 赤芍的薄層鑒別

2.1.3 黃連的薄層鑒別 稱取顆粒5 g，加甲醇25 mL，超聲處理25 min，濾過(guò)，取濾液作為供試品溶液；黃連對(duì)照藥材0.25 g，加甲醇25 mL，超聲處理30 min，濾過(guò)，取濾液作為對(duì)照藥材溶液；取鹽酸小檗堿對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液；稱取5 g陰性顆粒，按供試品溶液的制備方法制備成陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取上述四種溶液5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，用苯-乙酸乙酯-異丙醇-甲醇-水（4:2:1:1:0.2）展開(kāi)[3]，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的黃色熒光斑點(diǎn)，且陰性無(wú)干擾，見(jiàn)圖3。

圖3 黃連的薄層鑒別

2.1.4 牛蒡子的薄層鑒別 取本品顆粒10 g，加水20 mL溶解，加鹽酸3 mL，置水浴中加熱回流1小時(shí)，用三氯甲烷萃取兩次，每次15 mL，合并三氯甲烷液，水浴揮干，殘?jiān)右宜嵋阴?0 mL，活性炭1 g，加熱煮沸，濾過(guò)，濾液濃縮至2 mL，作為供試品溶液；取牛蒡子對(duì)照藥材粉末0.5 g，加水30 mL，煎煮1小時(shí)，冷卻，濾過(guò)，加鹽酸3 mL，置水浴中加熱回流1小時(shí)，用三氯甲烷萃取兩次，每次15 mL，合并三氯甲烷液，水浴揮干，殘?jiān)右宜嵋阴?0 mL，活性炭1 g，加熱煮沸，濾過(guò)，濾液濃縮至2 mL，作為對(duì)照藥材溶液；稱取10g陰性顆粒，按供試品溶液的制備方法制備成陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取上述四種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，用環(huán)己烷-乙酸乙酯-冰醋酸(5:5:0.2)為展開(kāi)劑展開(kāi)，取出，晾干，噴以5%三氯化鐵乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同斑點(diǎn)，且陰性無(wú)干擾，見(jiàn)圖4。

圖4 牛蒡子的薄層鑒別

2.1.5 玄參的薄層鑒別 取本品顆粒10 g，加甲醇25 mL，浸泡1小時(shí)，超聲處理30分鐘，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)铀?5 mL使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取2次，每次30 mL，合并正丁醇液，蒸干，殘?jiān)? mL甲醇使溶解，作為供試品；取玄參對(duì)照藥材粉末2 g，加甲醇25 mL，浸泡1小時(shí)，超聲處理30分鐘，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)铀?5 mL使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取2次，每次30 mL，合并正丁醇液，蒸干，殘?jiān)? mL甲醇使溶解，作為對(duì)照藥材溶液；稱取10 g陰性顆粒，按供試品溶液的制備方法制備成陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取上述四種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，用三氯甲烷-甲醇(5:1)為展開(kāi)劑展開(kāi)，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同斑點(diǎn)，且陰性無(wú)干擾，見(jiàn)圖5。

圖5 玄參的薄層鑒別

2.2 丹參素鈉的含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：DiamonsilTM C18色譜柱（150×4.6 mm，5 μm）；柱溫：30 ℃；流速：1 mL﹒min-1；靈敏度：0.05 AUFS；檢測(cè)波長(zhǎng)：281 nm。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取丹參素鈉對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含丹參素鈉 0.1161 mg的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 取適量顆粒，研細(xì)，置100 mL具塞錐形瓶中，加入60%甲醇50 mL，超聲提取40分鐘，放冷，稱定重量，以60%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 陰性溶液的制備 精密稱取缺丹參的陰性顆粒按供試品溶液制備方法制備，即得。

2.2.5 線性范圍的考察 精密吸取濃度為0.1161 mg﹒mL-1的丹參素鈉對(duì)照品2，4，6，8，10，15，20 μL，依次進(jìn)樣。測(cè)定峰面積值，并以峰面積值（A）對(duì)進(jìn)樣量C（μg）線性回歸，得回歸方程為：A = 529980C + 4789.6 （r=0.9997）。試驗(yàn)結(jié)果表明，丹參素鈉在0.2322 ~2.322 μg范圍內(nèi)峰面積值與進(jìn)樣量有良好線性關(guān)系。

2.2.6 專屬性考察 精密吸取丹參素鈉對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性溶液各10 μL，依次進(jìn)樣，測(cè)定得丹參素鈉對(duì)照品、供試品均出現(xiàn)丹參素鈉特征峰，而陰性溶液無(wú)該特征峰。供試品中丹參素鈉與其它組分可達(dá)基線分離，保留時(shí)間適當(dāng)，與鄰近色譜峰的分離度R>1.5，按丹參素鈉峰計(jì)算理論塔板數(shù)n>3000。結(jié)果表明，在選定條件下處方中其他成分對(duì)丹參素鈉的含量測(cè)定無(wú)干擾。所得圖譜見(jiàn)圖6、圖7、圖8。

圖6 丹參素鈉對(duì)照品溶液的HPLC圖譜

圖7 供試品溶液的HPLC圖譜

圖8 陰性溶液的HPLC圖譜

2.2.7 精密度考察 精密吸取丹參素鈉對(duì)照品溶液10μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積值并計(jì)算丹參素鈉的含量，計(jì)算丹參素鈉峰面積的RSD為0.26%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.2.8 重復(fù)性考察 按照“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法，取同一藥液6份制備供試品溶液，分別進(jìn)樣10 μL，測(cè)定峰面積值并計(jì)算丹參素鈉的含量。丹參素鈉的含量的RSD為1.47%，結(jié)果表明方法重現(xiàn)性良好。

2.2.9 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)考察 精密吸取同一供試品溶液和丹參素鈉對(duì)照品溶液，于0，2，4，6，8，10，12，24 h分別進(jìn)樣10 μL，并測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)的峰面積。結(jié)果表明，對(duì)照品溶液峰面積的RSD為1.20%，供試品溶液峰面積的RSD值為1.16%。供試溶液和對(duì)照品溶液在24小時(shí)內(nèi)較為穩(wěn)定，可滿足測(cè)定需要。

2.2.10 加樣回收率實(shí)驗(yàn)考察 精密吸取已知含量的供試品溶液（丹參素鈉含量為1.54 mg﹒g-1)適量，共計(jì)9份，置25 mL容量瓶中，分別加入丹參素鈉對(duì)照品溶液（0.1132mg﹒mL-1）1，1，1，2，2，2，3，3，3 mL，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品試液，測(cè)定峰面積并計(jì)算回收率，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率測(cè)定結(jié)果

結(jié)果表明，加樣回收率在95%～105%之間，平均回收率為97.08%，符合含量測(cè)定的要求。

2.2.11 樣品的含量測(cè)定 取三批樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制得供試品溶液。精密吸取對(duì)照品溶液及供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積值，計(jì)算丹參素鈉的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。由以上測(cè)定結(jié)果可知，3批樣品含量的均值為

表2 樣品中丹參素鈉含量測(cè)定結(jié)果

1.535 mg﹒g-1，考慮到藥材的來(lái)源、炮制加工、制劑生產(chǎn)及貯存等因素，含量限度在三批均值的基礎(chǔ)上下降20%，故暫定本品每克含丹參素鈉不得少于

1.228 mg。

3 討論

3.1 滋陰活血利咽顆粒源自于長(zhǎng)期運(yùn)用于臨床治療慢性咽炎的經(jīng)驗(yàn)方——滋陰活血利咽湯，該方以湯劑形式運(yùn)用于臨床多年，療效顯著。研制滋陰活血利咽顆粒，既體現(xiàn)了傳統(tǒng)湯劑療效好、見(jiàn)效快的特色，又有服用劑量小、貯存、攜帶方便等優(yōu)點(diǎn)。慢性咽炎的患者多伴有咽部發(fā)干、異物感或輕度疼痛等癥狀，本品較之于片劑、膠囊劑等其他固體劑型，更利于患者服用。

3.2 在鑒別中，分別以丹參素鈉對(duì)照品、丹參對(duì)照藥材、芍藥苷對(duì)照品、赤芍對(duì)照藥材、鹽酸小檗堿對(duì)照品、黃連對(duì)照藥材、牛蒡子對(duì)照藥材、玄參對(duì)照藥材為對(duì)照，對(duì)方中丹參、赤芍、黃連、牛蒡子、玄參進(jìn)行了薄層色譜鑒別。在對(duì)黃連進(jìn)行薄層鑒別中，預(yù)實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，后經(jīng)分析，或因黃連有效成分為生物堿，因此在展開(kāi)時(shí)適當(dāng)熏以氨蒸氣以克服拖尾現(xiàn)象；在對(duì)牛蒡子進(jìn)行薄層鑒別中，預(yù)實(shí)驗(yàn)中先采用常規(guī)方法以乙醇為提取溶劑制備牛蒡子對(duì)照藥材溶液，而所得薄層色譜上斑點(diǎn)偏多，主斑點(diǎn)Rf值偏高，難以與樣品對(duì)應(yīng)，多次試驗(yàn)之后，將牛蒡子藥材加鹽酸溶解，而后噴以5%三氯化鐵乙醇溶液顯色，鑒別其酚性成分，色譜圖上顯一個(gè)主斑點(diǎn)，特征性強(qiáng)。

3.3 含量測(cè)定中，丹參素鈉是處方中君藥丹參的主要水溶性有效成分，其含量的高低對(duì)制劑臨床療效影響較大，因此，選擇丹參素鈉含量作為含量測(cè)定指標(biāo)。

[1] 彭順林,鐘渠.滋陰活血利咽湯治療慢性咽炎47例療效觀察[J].甘肅中醫(yī),1998,11(6):14.

[2] 國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典[S].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010:70.

[3] 韋松基,王志萍,曹宇,等.壯藥依肝達(dá)顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2011, 22(11):2674.