王春艷 田晶

吉林醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室,吉林 吉林 132013

1. 材料與方法

1.1 實驗動物 體重180-220g的Wistar大鼠40只。

1.2 主要儀器與試劑

全自動生化分析儀；PCR反應(yīng)儀；DAB顯色試劑盒；UltraSensitiveTM S-P超敏試劑盒；一抗(兔抗鼠，結(jié)締組織生長因子)；鏈脲佐菌素（STZ）；銀杏葉提取物注射液。

1.3 分組、模型制備及給藥 40只Wistar大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1w，1w后大鼠隨機(jī)分為3組：正常組10只，模型組15只，治療組15只。按STZ 50mg/kg體重，一次性腹腔注射。7d后，大鼠表現(xiàn)為多飲、多食、多尿和體重減輕，連續(xù)兩次測定空腹血糖≥11.1mmol/L,非空腹血糖≥16.7 mmol/L，尿糖3+以上者列入糖尿病模型。造模過程中，正常組無死亡，模型組和治療組分別死亡3只和2只，原因可能是低血糖等。模型組和治療組各挑選一般狀態(tài)較好的10只繼續(xù)實驗。正常組、模型組經(jīng)胃給予生理鹽水2ml/kg，治療組經(jīng)胃給予銀杏葉提取物注射液4mg/kg，1次/日，持續(xù)12w。

1.4 方法

12w末大鼠斷頭，取血，全自動生化分析儀測定各組大鼠血糖(BG)、總膽固醇（TC）、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)。剖殺大鼠，剪取左心室心尖處心肌組織，浸于4%多聚甲醛中固定，進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋切片，免疫組化方法觀察心肌組織中CTGF的表達(dá)，棕黃色顆粒產(chǎn)物為陽性標(biāo)記。將剩余新鮮心肌組織保存于低溫冰箱，采用RT-PCR法檢測CTGF- mRNA的表達(dá)。

2. 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)用SPSS18.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行分析。計量資料以 ±s表示，進(jìn)行方差分析，P<0.05為有顯著性差異。

3. 結(jié)果

3.1 模型組與正常組相比，模型組BG、TC、TG、LDL均明顯升高，HDL明顯降低（P<0.05），差異有統(tǒng)計學(xué)意義。治療組與模型組相比，各項指標(biāo)均有改善，BG、TC、TG、LDL下降，HDL有所升高（P<0.05），差異有統(tǒng)計學(xué)意義。治療組與正常組比較，BG、TC、TG、LDL等生化指標(biāo)仍略高于正常組，HDL仍比正常組低（表1）。

表1 銀杏葉提取物對大鼠血液生化指標(biāo)的影響（±s）

表1 銀杏葉提取物對大鼠血液生化指標(biāo)的影響（±s）

注：與正常組比較,#:P<0.05；與模型組比較,*:P<0.05

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3.2 正常組心肌細(xì)胞內(nèi)可見少量分布均勻的棕黃色顆粒(圖1-A)。模型組心肌細(xì)胞膜和胞漿內(nèi)均可見濃密的深棕黃色顆粒，CTGF的表達(dá)顯著升高(圖1-B)。與模型組比較，治療組心肌細(xì)胞CTGF的表達(dá)明顯降低，但仍略高于正常組(圖1-C)。

圖1 各組大鼠心肌組織免疫組化染色（400×）

3.3 與正常組比較,模型組心肌組織CTGFmRNA表達(dá)明顯增高（P<0.05）,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。與模型組相比,治療組心肌組織CTGFmRNA表達(dá)明顯降低(P<0.05),差異有統(tǒng)計學(xué)意義。（表2，圖2，圖3）。

圖2 各組大鼠心肌組織中CTGF的RT-PCR電泳圖

表2 各組心肌組織中CTGFmRNA表達(dá)水平的比較（±s）

表2 各組心肌組織中CTGFmRNA表達(dá)水平的比較（±s）

注：與正常組比較,#:P<0.05；與模型組比較,*:P<0.05；

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圖3 各組大鼠心肌組織中CTGF mRNA表達(dá)水平比較

4. 討論

糖尿病誘發(fā)的高血糖和高血脂狀態(tài)可以破壞心肌細(xì)胞功能。Ren J等人[1]將正常大鼠的心肌細(xì)胞浸于高糖培養(yǎng)液中，24h即發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞功能受損。脂肪代謝障礙會使血漿中脂類物質(zhì)含量增加，血液黏稠度增加，脂類物質(zhì)還會粘附在血管內(nèi)皮細(xì)胞上，最終導(dǎo)致動脈粥樣硬化、心腦血管疾病的發(fā)生。本實驗中，造模組大鼠BG、TC、TG、LDL明顯升高，而HDL明顯降低。治療組BG、TC、TG、LDL降低，HDL升高。結(jié)果提示，銀杏葉提取物可以降低血糖、血脂，改善糖、脂代謝，減輕高血糖，高血脂對心肌細(xì)胞的破壞，對心肌具有一定的保護(hù)作用。

CTGF屬于即刻早期基因CCN基因家族和胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白相關(guān)蛋白超家族，是一種具有促進(jìn)細(xì)胞增殖，細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）合成，細(xì)胞黏附分子表達(dá)等多種生物活性的細(xì)胞因子。CTGF是TGF-β的一種下游元件，在結(jié)締組織形成過程中，TGF-β誘導(dǎo)CTGF的表達(dá)，CTGF的表達(dá)又進(jìn)一步介導(dǎo)TGF-β的部分生物作用。TGF-β可誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞、表皮成纖維細(xì)胞分泌CTGF，而CTGF又作用于相關(guān)細(xì)胞，參與TGF-β對這些細(xì)胞的促增生和促ECM合成。CTGF在正常生理狀態(tài)下少量表達(dá)，且主要表達(dá)于間質(zhì)細(xì)胞中[2]。本實驗中發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠心肌組織中CTGF基因及蛋白均呈強陽性表達(dá)。

綜上所述，在糖尿病動物模型中CTGF呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，其中高血糖狀態(tài)和TGF-β是誘導(dǎo)CTGF基因高表達(dá)的重要因素。CTGF對細(xì)胞增殖和基質(zhì)積聚具有特殊生物學(xué)活性。在本實驗中發(fā)現(xiàn)，銀杏葉提取物可以降低糖尿病大鼠心肌細(xì)胞CTGFmRNA及蛋白的表達(dá)，減弱TGF-β誘導(dǎo)組織纖維化的效應(yīng)，抑制心肌纖維化，提高心室順應(yīng)性，改善心肌細(xì)胞舒縮功能，延緩充血性心力衰竭的發(fā)生，對糖尿病心肌具有一定的保護(hù)作用，為糖尿病性心肌損傷的抗纖維治療提供了更特異的藥物作用靶點。

[1]Ren J,Gantant GA,Miller RE.et al. High extracelluar glueose impairs cardiac E-C coupling in a glycosylation-dependent manner.Am J Physiol,1997,273 (12):H2876-2883.

[2]Frazier KS,Paredes A,Duber P, et al. Connective tissue growth factor express in the rat remnant kidney model and association with tubular epithelialcell undergoing transdifferentiation.Vet Pathol,2000,37:328-335.