潘海龍 諸愛士 葉金娜 嚴(yán)飛娜

(1.浙江友邦生物科技有限公司，浙江 嵊州 312400；2.浙江科技學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江 杭州 310023)

目前對小米的研究重點(diǎn)是小米淀粉[1]、黃色素[2]、多酚[3]、VB2[4]、細(xì)糠油[5],而小米多糖的研究尚屬空白。人類對多糖的研究已有上百年的歷史,研究者從天然產(chǎn)物中提取多糖[6-11]，大量的藥理和臨床研究發(fā)現(xiàn),從天然產(chǎn)物中分離出來的多糖往往是一種免疫調(diào)節(jié)劑,它能激活免疫細(xì)胞而對正常細(xì)胞沒有毒副作用[12]。本文研究了小米多糖的提取，考察了顆粒與粉、液固比（去離子水與小米質(zhì)量比，下同）、提取時間、提取溫度、提取次數(shù)和攪拌速度6個因素的影響；在此基礎(chǔ)上，選取提取溫度、提取時間、液固比3個主要因素，采用正交設(shè)計(jì)法來優(yōu)化小米多糖的提取工藝，通過極差與方差分析，獲得最優(yōu)的工藝參數(shù)，從而提高了小米多糖的收率。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小米：市售，內(nèi)蒙古赤峰產(chǎn)；粉碎，過20目篩，60℃干燥箱中干燥備用。葡萄糖（分析純）：廣東汕頭市光華化學(xué)廠。苯酚（分析純）：杭州高晶精細(xì)化工有限公司。硫酸（分析純）：浙江衢州巨化試劑有限公司。

722E型可見分光光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司。DK-S24電熱恒溫水浴鍋：上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司。DHG-9123A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 多糖含量的測定

多糖含量的測定采用硫酸－苯酚法，含量以葡萄糖計(jì)[6、9]。

作工作曲線，將吸光度與含量擬合得關(guān)系式如下：X=0.0255Y－0.00006

其中：X－葡萄糖含量，g/L；Y－485 nm 處的吸光度；

多糖的收率依以下公式計(jì)算：

式中：η—小米多糖的收率，mg/g；V—粗多糖溶解定容后的總體積，L；M—原料小米用量，g。

1.2.2 單因素試驗(yàn)

小米5 g→熱水浸提→4000 r/min離心30 min→取上清液，加3倍95%乙醇→沉淀→4000 r/min離心30 min→過濾→粗多糖→溶解沉淀并定容→多糖含量測定。

實(shí)驗(yàn)在500 mL圓底三口燒瓶中進(jìn)行，用錨式攪拌槳攪拌，用冷凝管冷凝回流提取劑的蒸汽。分別研究顆粒與粉、提取溫度、提取時間、液固比、提取次數(shù)和攪拌速度6個因素對多糖提取收率的影響。

1.2.3 正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇影響多糖提取較大的3個因素，采用L9(34)正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，空白一列，通過極差與方差分析優(yōu)化提取工藝條件[13]。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素考察

2.1.1 顆粒與粉對收率的影響

液固比20:1、70℃、50 r/min攪拌、1次提取 1.5 h，對比顆粒與粉對多糖收率的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 顆?；蚍蹖κ章实挠绊慒ig.1 Effects of particle or powder on extraction yield

由圖1可見，相同條件下粉狀有利于多糖的提取。原因是多糖從顆粒內(nèi)部擴(kuò)散至溶液中需要更多的時間，而粉增大了傳質(zhì)的面積，并減小了傳遞的距離，即減少了傳質(zhì)阻力，故相同的提取時間，粉獲取的多糖多于顆粒；但對于顆粒，延長提取時間會提高多糖的收率。當(dāng)然，顆粒的粒度也會有一定的適宜值，實(shí)驗(yàn)沒有作進(jìn)一步的研究，以下實(shí)驗(yàn)采用粉狀。

2.1.2 液固比對收率的影響

粉狀、70 ℃、50 r/min攪拌、1次提取 1.5 h，研究液固比對收率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 液固比對收率的影響Fig.2 Effects of liquid-solid ratio on extraction yield

圖2表明多糖收率先隨液固比的增加而增大，這是因?yàn)樵趥髻|(zhì)過程中隨液固比的增加，溶液中多糖濃度被稀釋降低，從而增加了固相與液相間多糖的濃度差，使傳質(zhì)推動力增加，加快了傳遞速度；在液固比為20:1時收率達(dá)到最大，隨后收率反而有所下降，這可能是后續(xù)操作損失或操作、分析誤差所致。同時液固比增大會帶來一系列影響，如提取劑用量增大、后續(xù)分離操作產(chǎn)品損耗增多、設(shè)備容積加大、提取與分離操作的能耗也增加等等，所以在提取多糖時取液固比20:1。

2.1.3 提取時間對收率的影響

粉狀、液固比 20:1、70 ℃、50 r/min攪拌、1次提取，考察提取時間對收率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 提取時間對收率的影響Fig.3 Effects of extraction time on extraction yield

圖3表明多糖收率先隨時間的增加有比較大的增加，后隨時間增長有所減少。這是因?yàn)樾∶准?xì)胞破壁與多糖從固相傳遞到液相中需要一定的時間，隨著提取時間延長有更多的多糖擴(kuò)散至溶液中；但是提取時間過長會使已經(jīng)進(jìn)入溶液中的多糖因長時間處在較高溫度下而導(dǎo)致變性表現(xiàn)出收率有明顯降低，所以確定提取時間為2.0 h。

2.1.4 提取溫度對收率的影響

粉狀、液固比20:1、50 r/min攪拌、1次提取2.0 h，考察提取溫度對收率的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 提取溫度對收率的影響Fig.4 Effects of extraction temperature on extraction yield

圖4顯示多糖收率先隨溫度升高而增大，到70℃后，收率隨溫度升高而變小。其原因是溫度升高一則加快了分子熱運(yùn)動，提高了物質(zhì)的擴(kuò)散系數(shù)，同時降低了溶液的粘度，減少了傳質(zhì)的阻力，進(jìn)而加快了傳質(zhì)速度，在相同的提取時間里增加了多糖的提取量；但過高的溫度會使多糖分解變性而降低收率，因此確定多糖提取溫度為70℃。

2.1.5 提取次數(shù)對收率的影響

粉狀、液固比 20:1、70 ℃、50 r/min攪拌、提取2.0 h，考察提取次數(shù)對收率的影響。分別水提 1、2、3次，合計(jì)多糖收率，結(jié)果見表1。

表1 提取次數(shù)對收率的影響Table1 Effects of extraction times on extraction yield

由此可知，增加提取次數(shù)會提高多糖收率。2次提取，多糖總收率增幅為6.9%；3次提取，多糖總收率增幅為2次的2.6%，增幅不大。而增加提取次數(shù)會使操作成本成倍增加，故多次提取所帶來的收益可能彌補(bǔ)不了費(fèi)用的增大，故以下實(shí)驗(yàn)選提取次數(shù)為1次。

2.1.6 攪拌速度對收率的影響

粉狀、液固比20:1、70℃、1次提取2.0 h，考察攪拌速度對收率的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 攪拌速度對收率的影響Fig.5 Effects of stirring rate on extraction yield

圖5顯示收率先隨攪拌速度增大而增大，到150 r/min后，收率基本不變。其原因是攪拌加快了物質(zhì)的傳遞和擴(kuò)散，而攪拌速度達(dá)到一定值后，其強(qiáng)化作用已完全發(fā)揮而不再使收率增大，因此150 r/min的攪拌速度比較適宜。

2.2 正交設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，正交實(shí)驗(yàn)中采用粉狀、150 r/min、1次提取，選擇對小米多糖收率影響較大的提取溫度、提取時間及液固比3個因素進(jìn)行3水平的正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，表2給出了正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的因素和水平，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及極差分析見表3，趨勢圖見圖6，方差分析結(jié)果見表4。

表2 提取實(shí)驗(yàn)因素和水平Table 2 The levels and factors for extraction experiment

通過比較表3中各個因素極差R值的大小及圖6的形狀可以得知，在考察范圍內(nèi)，影響多糖提取因素的強(qiáng)弱順序?yàn)椋禾崛囟?液固比>提取時間。

由表4方差分析結(jié)果可以得知，在考察范圍內(nèi)，提取溫度對多糖收率有顯著性影響(P<0.05)，提取時間和液固比影響不顯著，但液固比影響程度明顯大于提取時間，結(jié)果與極差分析吻合。

綜上分析可得小米多糖最佳提取條件為A2B2C2，即提取溫度70℃，提取時間2 h，液固比20:1，結(jié)果與單因素考察相吻合。在此條件下重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，多糖收率分別為7.69 mg/g、7.79 mg/g、7.80 mg/g，多糖平均收率為7.76 mg/g，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=0.78%（n=3），說明提取工藝穩(wěn)定。

表3 正交設(shè)計(jì)結(jié)果Table 3 Results of orthogonal test

圖6 趨勢圖Fig.6 Tendency chart

表4 方差分析Table 4 Analysis of variance

3 結(jié)語

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：粉狀有利于多糖的提取，攪拌促進(jìn)了傳質(zhì)，150 r/min時就達(dá)到足夠的強(qiáng)化作用，多次提取會增加多糖收率，但提高幅度有限；正交優(yōu)化得到提取工藝的較佳條件是：提取溫度70℃、提取時間2.0 h、液固比20:1，此條件下小米多糖的收率達(dá)7.76 mg/g。

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