向雨秘 龍少波 朱 勍

(浙江工業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境學(xué)院，浙江 杭州 310014)

銅元素是生物體內(nèi)所必需的一種微量重金屬元素和必需的營(yíng)養(yǎng)素，在細(xì)胞中的含量?jī)H次于鋅和鐵，在各種有機(jī)體的基本生理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[1]。銅離子作為生命系統(tǒng)中重要的微量元素，它以作為金屬酶（如細(xì)胞色素氧化酶、過(guò)氧化物歧化酶、酪氨酸酶、多巴胺β-羥化酶、賴氨酰氧化酶和銅藍(lán)蛋白等二十多種酶類）的催化輔助因子的形式，廣泛參與了生命體系中電子傳遞、氧化還原等一系列過(guò)程，在生物體內(nèi)的酶反應(yīng)、酶轉(zhuǎn)錄以及一些氧化還原過(guò)程發(fā)揮重要的作用[2-3]。銅離子在生物體內(nèi)的含量很小，但銅缺乏可導(dǎo)致生長(zhǎng)和代謝的紊亂，銅離子的含量過(guò)多同樣也會(huì)對(duì)生物體產(chǎn)生巨大的毒害作用。體內(nèi)的銅離子代謝平衡受到破壞會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生，例如緬克斯綜合癥、威爾森氏綜合癥、家族性肌萎縮癥和阿爾茨海默氏癥等疾病[4-6]。因此，尋求一種快速靈敏簡(jiǎn)便的銅離子檢測(cè)方法在生物研究和醫(yī)學(xué)診斷中具有重要的意義。

目前傳統(tǒng)的檢測(cè)方法主要有原子吸收光譜法[7]、電感耦合等離子體-質(zhì)譜法[8]、電感耦合等離子體-原子發(fā)射光譜法[9]、分光光度測(cè)定方法[10]和循環(huán)伏安法[11]等檢測(cè)銅離子的方法。但這些檢測(cè)方法需要昂貴復(fù)雜的檢測(cè)設(shè)備，且檢測(cè)過(guò)程中較為繁瑣，不適合大批量檢測(cè)和實(shí)時(shí)檢測(cè)。熒光探針檢測(cè)方法具有靈敏度高，選擇性好，方法簡(jiǎn)便等優(yōu)勢(shì)，并且可通過(guò)熒光成像技術(shù)對(duì)生物體內(nèi)的銅離子進(jìn)行觀測(cè)和實(shí)時(shí)檢測(cè)[12,13]。因此，熒光探針檢測(cè)技術(shù)作為一種新型高效簡(jiǎn)便的檢測(cè)手段，被廣泛的應(yīng)用于銅離子的檢測(cè)中。本文通過(guò)參考一些最新前沿的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，根據(jù)銅離子熒光探針的不同作用原理，總結(jié)了近幾年銅離子熒光探針的研究進(jìn)展。

1 基于光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移過(guò)程的熒光探針

在眾多銅離子熒光探針中，基于光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移(photoinduced electron transfer,PET)機(jī)理[14]而設(shè)計(jì)的熒光分子探針最為常見，而這種探針也常常用于對(duì)其他陽(yáng)離子的檢測(cè)中。一般情況下，一個(gè)典型的PET結(jié)構(gòu)是由識(shí)別基團(tuán)通過(guò)間隔基和熒光基團(tuán)相連而成，PET熒光探針的熒光基團(tuán)和識(shí)別基團(tuán)之間存在著光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移，對(duì)熒光有非常強(qiáng)的猝滅作用。

2006年，Zeng等[15]報(bào)道了一種高度選擇性的Cu+熒光探針，機(jī)理見Scheme 1所示。該探針采用硫冠醚結(jié)構(gòu)作為探針的識(shí)別基團(tuán)，而熒光基團(tuán)則為BODIPY染料。由于PET作用，探針本身的熒光強(qiáng)度十分微弱，當(dāng)探針的識(shí)別基團(tuán)與Cu+螯合后，PET受到限制，探針的量子產(chǎn)率從之前的0.016增至0.13，發(fā)出強(qiáng)烈熒光。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在所有檢測(cè)的離子 (Ca2+、Mg2+、Mn2+、Fe2+、Co2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+、Cu+)中，該探針對(duì) Cu+表現(xiàn)出良好的選擇性和靈敏性。最后成功的應(yīng)用于活細(xì)胞熒光成像檢測(cè)，有助于幫助闡釋亞銅離子在細(xì)胞內(nèi)的生理學(xué)及病理學(xué)作用。

2010年，Domaille D W等[16]對(duì)此探針進(jìn)行了改進(jìn)，將硫冠醚結(jié)構(gòu)連接到BODIPY的5位，合成了一種新型的探針結(jié)構(gòu)。該探針與Cu+螯合后熒光強(qiáng)度隨之增加了20倍，并表現(xiàn)出良好的選擇性。

Scheme 1

2 基于C-O鍵斷裂過(guò)程的熒光探針

基于C-O鍵斷裂作用的熒光探針最為常見。熒光探針分子中的熒光團(tuán)通過(guò)醚鍵和識(shí)別基團(tuán)連接后熒光淬滅，當(dāng)與目標(biāo)作用后醚鍵斷裂，熒光團(tuán)上的識(shí)別基團(tuán)脫落而發(fā)出強(qiáng)熒光。這種熒光探針主要是通過(guò)識(shí)別基團(tuán)與熒光團(tuán)之間的醚鍵斷裂而檢測(cè)，因此，該探針也常常用于酶活性的檢測(cè)中。2010年，Taki M等[17]合成了一種以熒光素為熒光基團(tuán)的的熒光探針（Scheme 2），這種新型的熒光探針和銅離子作用后發(fā)生水解，熒光素上的識(shí)別基團(tuán)脫落，隨后產(chǎn)生強(qiáng)熒光的熒光素。通過(guò)對(duì) Ca2+、Mg2+、Mn2+、Fe2+、Co2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+、Cu+等離子的檢測(cè)，該探針表現(xiàn)出極好的選擇性和極高的靈敏性，并成功的用于細(xì)胞熒光成像檢測(cè)。該探針設(shè)計(jì)簡(jiǎn)便，靈敏度高且容易操作，因而被廣泛應(yīng)用于銅離子的檢測(cè)。

Scheme 2

3 基于胺及酰胺配位作用的熒光探針

由于胺中N原子上具有孤對(duì)電子，它可以和Cu2+的空軌道發(fā)生配位，因此利用配位作用可以用來(lái)識(shí)別銅離子，常用來(lái)作為Cu2+的識(shí)別基團(tuán)有胺和酰胺基團(tuán)。近年來(lái)，羅丹明的內(nèi)酰胺螺旋結(jié)構(gòu)已成為了研究熱點(diǎn)[18]：羅丹明B處于內(nèi)酰胺螺環(huán)狀時(shí)并無(wú)熒光，當(dāng)內(nèi)酰胺螺環(huán)狀結(jié)構(gòu)受到破壞而開環(huán)時(shí)會(huì)產(chǎn)生玫瑰色和強(qiáng)熒光。這種獨(dú)特的開環(huán)識(shí)別的機(jī)理已被廣泛的用于制備熒光增強(qiáng)型Cu2+熒光分子探針。

1997年，Czarinik等[19]首次利用該機(jī)理設(shè)計(jì)和合成了羅丹明B酰肼探針（Scheme 3），該探針可以選擇性識(shí)別銅離子，其原理是基于銅離子催化羅丹明B酰肼水解生成強(qiáng)熒光的羅丹明B分子。

Scheme3

2012年，Kumar M等[20]巧妙的對(duì)該探針進(jìn)行了改進(jìn)，將具有熒光的酰肼衍生物替代酰肼，設(shè)計(jì)和合成了一種新型的銅離子熒光探針。機(jī)理見Scheme 4。該探針與銅離子作用后，羅丹明B酰肼結(jié)構(gòu)發(fā)生水解，生成了強(qiáng)熒光的羅丹明B分子以及強(qiáng)熒光的酰肼衍生物（HZD）。因此，該探針可以測(cè)定雙發(fā)射波長(zhǎng)的熒光信號(hào)，更能精確的檢測(cè)銅離子的濃度變化。并且該探針成功地用于細(xì)胞熒光成像檢測(cè)，為進(jìn)一步在分子水平上對(duì)銅離子的的研究奠定了基礎(chǔ)。

Scheme 4

4 基于FRET作用的熒光探針

熒光共振能量轉(zhuǎn)移 (fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET)[21]是激發(fā)態(tài)時(shí)能量供體與受體通過(guò)遠(yuǎn)程偶極-偶極耦合作用，發(fā)生的非輻射能量轉(zhuǎn)移過(guò)程。熒光共振能量轉(zhuǎn)移的效率與供受體熒光團(tuán)之間的距離有著十分重要的關(guān)系，因此，任何改變兩個(gè)熒光團(tuán)的距離和方向都能影響著的FRET效率。相比于單信號(hào)的熒光探針，F(xiàn)RET熒光探針能夠?qū)崿F(xiàn)更大的stoke位移，減少背景信號(hào)的干擾；通過(guò)檢測(cè)雙波長(zhǎng)的發(fā)射光譜，能夠?qū)崿F(xiàn)比率檢測(cè)，削弱其他因素的干擾，極大地提高了探針的靈敏性。

2012年，Lin Yuan等[22]根據(jù)羅丹明B酰肼與銅離子的配位作用機(jī)理設(shè)計(jì)了一種新型的FRET熒光探針（Scheme 5）。當(dāng)環(huán)境中不存在銅離子時(shí)，由于探針中羅丹明B酰胺處于閉合狀態(tài)，此時(shí)從香豆素到羅丹明B的FRET是被阻止的，只能檢測(cè)到供體的發(fā)射波長(zhǎng)。當(dāng)環(huán)境中存在銅離子時(shí)，探針的內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu)打開，F(xiàn)RET開啟，能量發(fā)生了轉(zhuǎn)移，此時(shí)用410 nm波長(zhǎng)的光激發(fā)，可以檢測(cè)到581 nm的主峰和473 nm的小峰，分別對(duì)應(yīng)著羅丹明B基團(tuán)和香豆素基團(tuán)的最大發(fā)射波長(zhǎng)，把581 nm和473 nm的熒光強(qiáng)度的比值作為檢測(cè)值，隨著銅離子的濃度增大，比值也相應(yīng)的增加。這種比率檢測(cè)方法能夠極大降低檢測(cè)環(huán)境中背景的干擾，提高了探針的靈敏度。通過(guò)對(duì)Ca2+、Mg2+、Mn2+、Fe3+、Co2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+、Cu+、Ag+、Cd2+、Cr3+、Hg2+、Pb2+、Al3+、Sn2+等離子的檢測(cè)，探針對(duì)Cu2+表現(xiàn)出極好的選擇性和極高的靈敏性。

Scheme 5

Lee等[23]設(shè)計(jì)了雙供體 FRET熒光探針（Scheme 6），該探針以連接兩個(gè)丹磺酰熒光染料作為雙供體，極大的提高了該探針的靈敏度和準(zhǔn)確性。

2010年，Wegner S V等[24]在酵母細(xì)胞內(nèi)通過(guò)基因編碼表達(dá)構(gòu)建了一個(gè)Amt1-FRET銅離子熒光探針。該探針由青色熒光蛋白（CFP）通過(guò)類金屬硫蛋白的多肽(Amt1)和和黃色熒光蛋白（YFP）連接而成。它主要通過(guò)Amt1上的巰基與銅離子發(fā)生絡(luò)合作用后改變其空間構(gòu)象，使得兩個(gè)熒光基團(tuán)相互靠近，能量發(fā)生了轉(zhuǎn)移，從而達(dá)到檢測(cè)的目的。該探針是由基因編碼表達(dá)而成的，減少了有機(jī)染料給細(xì)胞帶來(lái)的毒害作用，提高了探針的靈敏度。它在酵母細(xì)胞中對(duì)銅離子檢測(cè)的良好表現(xiàn)也為在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)對(duì)銅離子進(jìn)行動(dòng)態(tài)研究提供了可能。

Scheme 6

5 基于核磁共振技術(shù)的雙功能探針

核磁共振成像（MRI）檢測(cè)[25]是最近新興發(fā)展的一種新的檢測(cè)技術(shù)，相比于熒光探針檢測(cè)技術(shù)，具有更高的空間分辨率和對(duì)比度，且可同時(shí)獲得三維解剖結(jié)構(gòu)及生理信息等優(yōu)勢(shì)，因此，MRI探針也常常用于對(duì)銅離子的檢測(cè)中。2012年，Zhang等[26]將一萘衍生物熒光基團(tuán)連接在Gd3+-DO3A核心結(jié)構(gòu)上，設(shè)計(jì)和合成了一個(gè)雙功能探針 （Scheme 7）。當(dāng)環(huán)境中沒有銅離子時(shí)，Gd3+-DO3A核心結(jié)構(gòu)由于萘衍生物導(dǎo)致的空間位阻使環(huán)境中的水未能進(jìn)入，降低了其縱向弛豫值。當(dāng)探針與銅離子結(jié)合后，萘衍生物受體與銅離子形成螯合結(jié)構(gòu)，減少了對(duì)Gd3+-DO3A的阻塞作用，使得環(huán)境中的水能夠進(jìn)入里面，提高了探針的縱向弛豫值，發(fā)出明顯的核磁共振信號(hào)，而萘衍生物熒光基團(tuán)由于銅離子的螯合作用熒光發(fā)生淬滅。該探針采用了雙信號(hào)檢測(cè)，既然檢測(cè)MR信號(hào)，又能檢測(cè)熒光信號(hào)變化，提高了探針的靈敏度和準(zhǔn)確性。

Scheme 7

6 展望

本文綜述了各種類型的銅離子熒光探針，總結(jié)了大多數(shù)銅離子熒光探針的設(shè)計(jì)原理和應(yīng)用。隨著對(duì)銅離子研究的不斷深入，熒光探針在生物及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中越來(lái)越發(fā)揮其重要的作用。相信，通過(guò)不斷的努力，最終會(huì)開發(fā)一種更高效、更靈敏、簡(jiǎn)單方便的探針，在生物學(xué)研究、環(huán)境監(jiān)測(cè)、臨床醫(yī)學(xué)以及疾病診斷等領(lǐng)域方面發(fā)揮著重要的作用。

[1]Barceloux D G J,Barceloux D.Copper[J].Clin.Toxicol.,1999,37(2):217-230.

[2]Gaggelli E,Kozlowski H,Valensin D,et al.Copper Homeostasis and Neurodegenerative Disorders(Alzheimer's,Prion,and Parkinson's Diseases and Amyotrophic Lateral Sclerosis)[J].Chem.Rev.,2006,106(6)：1995-2044.

[3]劉希玲,鄭明花,金京一.銅離子熒光傳感器的研究進(jìn)展[J].廣州化工,2010,38(4):30-33.

[4]Harrison M D,Dameron C T.Molecular mechanisms of copper metabolism and the role of the Menkes disease protein[J].J.Biochem.Mol.Toxicol.,1999,13(2):93-106.

[5]Strausak D,Mercer J F B,Dieter H H,et al.Copper in disorders with neurological symptoms:Alzheimer's,Menkes,and Wilson diseases [J].Brain.Res.Bull.,2001,55(2):175-185.

[6]Waggoner D J,Bartnikas T B,Gitlin J D.The role of copper in neurodegenerative disease [J].Neurobiology of Disease,1999,6(4):221-230.

[7]Pourreza N,Hoveizavi R.Simultaneous preconcentration of Cu,Fe and Pb as methylthymol blue complexes on naphthalene adsorbent and flame atomic absorption determination[J].Analytica Chimica Acta,2005,549(1):124-128.

[8]Becker J S,Zoriy M V,Pickhardt C,et al.Imaging of copper,zinc,and other elements in thin section of human brain samples(hippocampus)by laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry [J].Anal.Chem.,2005,77(10):3208-3216.

[9]Romani J O,Moreda A P,Barrera A B,et al.Evaluation of commercial C18 cartridges for trace elements solid phase extraction from seawater followed by inductively coupled plasma-optical emission spectrometry determination[J].Analytica Chimica Acta,2005,536(2):213-218.

[10]Pinto J J,Moreno C,Garcia-Vargas M.A very sensitive flow system for the direct determination of copper in natural waters based on spectrophotometric Detection[J].Talanta,2004,64(22):562-565.

[11]Beni V,Ogurtsov V I,Bakunin N V,et al.Development of a portable electroanalyticalsystem forthe stripping voltammetry of metals:determination of copper in acetic acid soil extracts[J].Analytica Chimica Acta,2005,552(1):190-200.

[12]Zhao M L,Yang X F,He S F,et al.A rhodamine-based chromogenic and fluorescent chemosensor for copper ion in aqueous media[J].Sensors and Actuators B-Chemical,2009,135(2):625-631.

[13]王松濤,姜云,程秀萍,等.銅離子傳感器的研究進(jìn)展 [J].渤海大學(xué)學(xué)報(bào),2010,31(3):231-236.

[14]Valeur B,Leray I.Design principles of fluorescent molecular sensors for cation recognition[J].Coordination Chemistry Reviews,2000,205:3-40.

[15]Zeng L,Miller E W,Pralle A,et al.A selective turn-On fluorescent sensor for imaging copper in living cells [J].J Am Chem Soc,2006,128(1):10-11.

[16]Domaille D W,Zeng L,Chang C J.Visualizing ascorbatetriggered release of labile copper within living cells using a ratiometric fluorescent sensor[J].J.Am.Chem.Soc.,2010,132(4):1194–1195.

[17]Taki M,Iyoshi S,Ojida A,et al.Development of highly sensitive fluorescent probes for detection of intracellular copper(I)in living systems[J].J Am Chem Soc,2010,132(17):5938–5939.

[18]王曉春,劉曉瑞,楊永亮,等.羅丹明類熒光探針在重金屬和過(guò)渡金屬離子檢測(cè)中的應(yīng)用 [J].光譜學(xué)與光譜分析.2010,30(10):2693-2699.

[19]Dujols V,Ford F,Czarnik A W.Long-wavelength fluorescent chemodosimeter selective for Cu(II)ion in water[J].J.Am.Chem.Soc.,1997,119(31):7386-7387.

[20]Kumar M,Kumar N,Bhalla V,et al.Highly Selective fluorescence turn-on chemodosimeter based on rhodamine for nanomolar detection of copper ions[J].Org Lett,2012,14(1):406-409.

[21]孫學(xué)剛,張麗華,姜勇.FRET的理論基礎(chǔ)及應(yīng)用 [J].中國(guó)病理生理雜志,2004,20(9):1721-1724.

[22]Yuan L,Lin W Y,Chen B,et al.Development of FRET-based ratiometric fluorescent Cu2+chemodosimeters and the applications for living cell imaging[J].Org Lett,2012,14(2):432-435.

[23]Lee M H,Kim H,Yoon S,et al.Metal ion induced FRET OFF-ON in tren/dansyl-appended rhodamine[J].Org Lett,2008,10(2):213-216.

[24]Wegner S V,Arslan H,Sunbul M,et al.Dynamic copper(I)imaging in mammalian cells with a genetically encoded fluorescent copper(I)sensor[J].J Am Chem Soc,2010,132(8):2567–2569.

[25]Werner E J,Datta A,Jocher C J,et al.High-relaxivity MRI contrast agents:where coordination chemistry meets medical imaging[J].Angew Chem Int Ed,2008,47(45):8568-8580.

[26]Zhang X L,Jing X,Liu T,et al.Dual-functional gadolinium-based copper(II)probe for selective magnetic resonance imaging and fluorescence sensing[J].inorg Chem,2012,51(4):2325-2331.