袁 文 杰， 陳 麗 杰， 孔 亮， 孜 力 汗， 任 劍 剛， 白 鳳 武

（1.大連理工大學 生命科學與技術學院，遼寧 大連 116024；2.大連海洋大學 海洋科技與環(huán)境學院，遼寧 大連 116023）

0 引 言

燃料乙醇是迄今為止國內外公認的，發(fā)展最成熟的生物能源產品，可以與汽油以一定比例配混使用.然而，我國人口多耕地少的基本國情，使目前糧食類淀粉質原料燃料乙醇產業(yè)的規(guī)?；l(fā)展受到了制約.不與人爭糧，不與糧爭地，是當前乃至未來我國燃料乙醇產業(yè)發(fā)展的基本方針.

菊芋俗稱洋姜或鬼子姜，與其他農作物相比具有適應性強、耐貧瘠、耐寒、耐旱、種植簡易及產量高等特點［1］.利用我國現(xiàn)有的非耕地資源種植歐亞菊芋，不僅可以為生物能源產品生產開辟新的原料來源，而且有助于生態(tài)環(huán)境保護.我國已將菊芋作為重點發(fā)展的非糧能源植物列入生物產業(yè)發(fā)展“十一五”“十二五”規(guī)劃中.

在前期的研究中，本實驗室經過篩選、馴化和誘變選育了乙醇發(fā)酵性能優(yōu)良且具有菊粉酶生產能力的馬克斯克魯維酵母（Kluyveromyces marxianusYX01，K.marxianusYX01），研究開發(fā)了集菊粉酶生產、菊粉水解和乙醇發(fā)酵為一體（simultaneous inulase production， inulin saccharification and ethanol fermentation，SISF）的技術，可以通過一步法將菊芋粉發(fā)酵生成乙醇［2］.本工藝可采用生菊芋粉進行乙醇發(fā)酵，原料不需蒸煮和預先糖化，節(jié)省能源及設備投資，降低生產成本，同時還減少了因蒸煮而造成的可發(fā)酵性糖的損失.但是為了滿足SISF工藝，必須使發(fā)酵過程中的菊粉酶分泌、菊粉酶酶解速度與發(fā)酵速度相等.雖然K.marxianusYX01具有良好的菊粉酶生產能力，但實驗結果表明，發(fā)酵條件下K.marxianusYX01的菊粉酶生產能力不足，致使發(fā)酵過程中酶解速度較慢，達到發(fā)酵終點所需的發(fā)酵時間比現(xiàn)有乙醇生產工藝顯著延長，發(fā)酵罐設備生產強度相應降低.提高發(fā)酵條件下菊粉酶的表達量和活性，可能是解決這一問題的有效途徑.

由于K.marxianus屬于非常規(guī)酵母，用于基因表達的載體種類還不多，并且?guī)в懈郊有洼d體的細胞不適于長期培養(yǎng)［3－5］.染色體整合表達是穩(wěn)定表達外源基因的另一選擇.Douglas等［6］使用來源于S.cerevisiae的可重復使用的URA3基因簇表達系統(tǒng)在K.marxianusLDH基因位置插入外源基因并成功表達.

核糖體rDNA序列是真核生物基因組DNA中的中等重復并有轉錄活性的基因家族.酵母基因組中rDNA有100～200個重復單元，是構建高拷貝數(shù)整合型載體較為理想的重復順序.以rDNA為整合位點提高整合拷貝數(shù)的應用策略，已經成功應用于多種外源基因的表達［7－10］.唐南筠等［11］也利用rDNA作為整合位點，實現(xiàn)外源基因在K.lactis中的表達.由于rDNA在物種中具有很強的保守性，Klabunde等［12］以來源于H.polymorpha的rDNA為整合位點，成功實現(xiàn)了外源基因在H.polymorfa、P.stipitis、S.cerevisiae和A.adeninivorans中的表達.因為K.marxianus的rDNA序列尚屬未知，本文嘗試以S.cerevisiae的rDNA為整合位點，實現(xiàn)INU基因在K.marxianusYX01中的過量表達，并對獲得的基因工程菌進行菊芋生料乙醇發(fā)酵研究，以期為實現(xiàn)菊芋非糧乙醇工業(yè)化生產奠定基礎.

1 材料與方法

1.1 實驗菌株和質粒

菌株及質粒列于表1.其中K.marxianusYX01為本實驗的出發(fā)菌株，分泌菊粉酶并具有良好的乙醇發(fā)酵性能；釀酒酵母S.cerevisiae288c為模式菌株，用作擴增pgk啟動子和整合位點rDNA的模板.

1.2 酶和化學試劑

引物合成和序列測定委托TaKaRa（大連）公司完成.TaqDNA聚合酶、T4DNA連接酶、限制內切酶、DNA marker等購自TaKaRa（大連）公司；G418購自Sigma公司（美國，密蘇里州）；DNA純化試劑盒、質粒提取試劑盒與凝膠回收試劑盒均購自Solarbio公司（北京）.菊粉購自內蒙古億利生物技術有限公司；菊芋購自山東濟寧，用前進行烘干粉碎，稀酸水解處理后100g菊芋粗粉中含有65g總糖.

1.3 培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基、YPD選擇培養(yǎng)基、菊粉培養(yǎng)基及菊芋粗粉發(fā)酵培養(yǎng)基同文獻［13］.

1.4 引物設計

根據(jù)S.cerevisiaepgk啟動子（GenBank登錄號BK006937.1）序列，設計引物pgk forward primer和pgk reverse primer，5′和3′端分別引入酶切位點SpeⅠ和SacⅡ.根據(jù)Saccharomyces paradoxusNRRL Y－17217 的 rDNA 基 因（GenBank登錄號 BR000309.1）序列，設計引物rDNA F 和rDNA R，分別在 5′和 3′端引入BamHⅠ和BssHⅡ酶切位點.根據(jù)K.marxianus的菊粉酶基因（GenBank登錄號X57202）序列，設計引物inu F和inu R，在5′和3′端引入SacⅡ和HpaⅠ酶切位點（引物序列見表2）.

表1 實驗菌株和質粒Tab.1 Strains and plasmids

表2 文中所用的引物序列Tab.2 The primer sequences in this paper

1.5 表達載體各元件的克隆

利用設計的引物及高保真EasyPfuDNA聚合酶，按表3反應程序PCR擴增表達載體構建所需的3個元件片段.

表3 3個克隆元件的PCR反應程序Tab.3 The PCR systems used in cloning of three components

1.6 菊粉酶基因整合表達載體的構建

PCR產物經凝膠回收純化后，分別與克隆載體pMD19－T連接并轉化E.coliDH5α感受態(tài)細胞.陽性克隆提取質粒后測序，驗證正確的質粒分別 命 名 為 pMD19－T／inu、pMD19－T／pgk 和pMD19－T／rDNA.載體pMD19－T／pgk經SpeI／SacⅡ雙酶切后，回收目的片段，用T4DNA連接酶連接至經SpeI／SacⅡ雙酶切的pFA6a，重組正確的載體命名為pFA6a－pgk；將載體pMD19－T／inu經SacⅡ／HpaⅠ雙酶切后，回收目的片段，用T4DNA連接酶連接至經SacⅡ／HpaⅠ雙酶切的pFA6a－pgk，重組正確的載體命名為pFA6a－pgk－inu.將 載 體 pMD19－T／rDNA 經BamHⅠ／BssHⅡ雙酶切后，回收目的片段，用T4DNA連接酶連接至經BamHⅠ／BssHⅡ雙酶切的 pFA6a－pgk－inu，重 組 正 確 的 載 體 命 名 為pFA6a－rDNA－pgk－inu.質粒的提取、酶切、連接和E.coli轉化均按Sambrook等［14］的方法進行.

1.7 重組質粒載體轉化K.marxianus YX01

重組質粒載體pFA6a－rDNA－pgk－inu用SphⅠ酶切線性化后，利用電擊法轉化K.marxianusYX01.操作方法按說明書進行.SphⅠ的單酶切位點位于3.3kb rDNA片段的中部，重組質粒載體經該酶線性化后可以特異整合到K.marxianusYX01染色體的特定部位，以實現(xiàn)外源基因的同源重組.

1.8 重組菌的篩選與鑒定

用含300μg／mL G418的YPD選擇培養(yǎng)基篩選陽性重組菌.提取轉化子的基因組DNA，利用PCR方法進行驗證.鑒定引物序列為Id F／R（表2）.篩選得到的重組菌株命名為K／r.

1.9 重組菌株產菊粉酶性能的考察

在由PCR鑒定得到的重組菌株中，通過初篩得到發(fā)酵性能較好的兩株菌株 K／r－1和 K／r－2.取菌濃度相同的K.marxianusYX01和重組菌株 K／r－1和 K／r－2，接至菊粉培養(yǎng)基，使初始接種量OD值為1.250mL搖瓶中裝液量100mL，8層紗布封口，搖床轉速150r／min，溫度30℃條件下培養(yǎng).每24h取樣測定生物量（干質量）、菊粉酶活性.測定方法同文獻［13］.

1.10 重組菌株的菊芋生料補料發(fā)酵

取菌濃度相同的K.marxianusYX01和重組菌株 K／r－1和 K／r－2，接至200g／L 菊芋粗粉發(fā)酵培養(yǎng)基中（糖濃度為127g／L），使初始接種量OD值為1.250mL搖瓶中裝液量100mL，厭氧塞封口，搖床轉速150r／min，溫度30℃條件下培養(yǎng).發(fā)酵12h時向培養(yǎng)基中補加8g粗菊粉，使菊粉終濃度達到280g／L，每12h取樣測定總糖及乙醇含量.測定方法同文獻［13］.

2 結果與討論

2.1 菊粉酶基因多拷貝整合表達載體的構建

分別以K.marxianusYX01和S.cerevisiae288c的基因組DNA為模板，PCR擴增獲得INU基因、pgk啟動子基因、rDNA基因，經Blast比對，3個PCR產物的DNA序列與模板的相似性達100%.依次將克隆得到的目的片段連接至pFA6a骨架上，成功構建得到重組整合表達載體pFA6a－rDNA－pgk－inu.重組質粒的 PCR 驗證結果和酶切結果都與理論相符.整個構建過程如圖1所示.

2.2 K.marxianus YX01的轉化及重組菌株的鑒定

利SphⅠ酶切載體 pFA6a－rDNA－pgkinu，回收9.7kb的線性目的片段，利用電擊法進行轉化.對選擇平板上的抗性菌落進行PCR鑒定.PCR鑒定以重組菌株的基因組DNA為模板，以YZ F／R為引物進行PCR擴增.擴增的片段包括Kan R后半部分基因、pgk啟動子基因和INU基因的前半部分，預期的目標序列的長度為1.9kb；而出發(fā)菌株無整合片段，PCR結果應為陰性.PCR的電泳結果如圖2所示.基因工程菌在無篩選壓力下連續(xù)培養(yǎng)50代以上，仍然保持G418抗性.實驗中選擇了釀酒酵母rDNA結構單元中的NTS1至28SrDNA部分片段，長約3.3kb作為同源重組位點，整合的質粒長度基本與rDNA的一個重復單元長度一致，使得整合后的質粒比較穩(wěn)定.

2.3 重組菌株產酶性能的考察

將初篩選出來的兩株菌 K／r－1和 K／r－2接種在菊粉培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，考察菊粉酶分泌情況.按照前述的實驗方法1.9，在搖瓶中對重組菌株的生長和產酶能力進行了測定，實驗結果如圖3所示（A為酶活力，ρ為菌濃度）.

圖1 整合載體pFA6a－rDNA－pgk－inu的構建策略Fig.1 The construction strategy of recombinant vector pFA6a－rDNA－pgk－inu

圖2 陽性轉化子的PCR鑒定結果Fig.2 The detection of positive transformant by PCR

圖3 出發(fā)菌株和重組菌株 K／r－1、K／r－2的生長情況及菊粉酶活力的變化Fig.3 Yeast cell growth and inulinase activity of the host and recombinants K／r－1and K／r－2

從圖3中可以看出，兩個重組菌株的生物量幾乎與出發(fā)菌株一致，維持在9g／L左右.重組菌株K／r－1和K／r－2分泌的菊粉酶活力均高于出發(fā)菌株.在168h時，K／r－2菌株的最高酶活力達140U／mL，K／r－1菌株的最高酶活力為120U／mL，分別是出發(fā)菌株（80U／mL）的1.8、1.5倍，說明所構建的質粒載體pFA6a－rDNA－pgk－inu轉化K.marxianus后成功地實現(xiàn)了菊粉酶基因的過量表達，達到了本文研究的預期目的.來自于釀酒酵母的rDNA可以整合到非常規(guī)酵母K.marxianus的染色體基因組中，且不影響生長，說明rDNA位點整合在真核微生物中存在廣泛的普適性.rDNA位點整合將有益于外源基因在K.marxianus中的表達，促進該種微生物在工業(yè)生物技術中的應用.

2.4 重組菌株的菊芋粉補料批式發(fā)酵

對重組菌株 K／r－2和 K／r－1的菊芋粉乙醇發(fā)酵進行了生料的批式補料工藝的考察.發(fā)酵使用菊芋粗粉培養(yǎng)基，無其他營養(yǎng)鹽添加，結果如圖4所示（ρts為總糖濃度，ρe為乙醇濃度）.

圖4 出發(fā)菌株和重組菌株 K／r－1、K／r－2的菊芋粉乙醇補料發(fā)酵性能Fig.4 Ethanol fermentation performance of K／r－1 and K／r－2in the fed－batch fermentations from rawJerusalem artichoke

由實驗結果可以看出，重組菌株K／r－2和K／r－1的發(fā)酵性能明顯好于出發(fā)菌株K.marxianusYX01.發(fā)酵在48h達到終點，重組菌株的乙醇產量均比出發(fā)菌株要高，其中K／r－2的最高乙醇濃度為76.5g／L，K／r－1的最高乙醇濃度為73.5 g／L，均高于出發(fā)菌株的71.5g／L.在發(fā)酵過程中，發(fā)酵醪中總糖水平急劇下降，說明出發(fā)菌株K.marxianusYX01的發(fā)酵能力很強.種子培養(yǎng)液中具有的菊粉酶活力使得發(fā)酵液中的還原糖在發(fā)酵初期達到很高水平，在12h時，K／r－2的為26g／L左右，而出發(fā)菌株K.marxianusYX01的為16g／L，與種子液的菊粉酶活力正相關.補加菊芋粉后，發(fā)酵醪中總糖濃度得到了回升，隨著發(fā)酵的進行逐漸被消耗.到發(fā)酵終點時，K／r－2剩余總糖為25g／L左右，而出發(fā)菌株K.marxianusYX01的為30g／L，說明由于菊粉酶活力的升高，糖的利用率及乙醇對糖的得率都得到了提升，證明了菊粉酶活性是SISF技術的關鍵控制點的推論.

菊粉酶是能夠水解β－2，1－D－果聚糖苷鍵的一類水解酶，能夠水解菊粉為果糖及低聚果糖，在果糖生產及菊芋生產發(fā)酵產品等方面引起了廣泛關注.來源于Aspergillusniger和K.marxianus的菊粉酶基因已經成功地實現(xiàn)了在P.pastoris中的表達［15－16］.Liu等構建了菊粉酶的酵母細胞表面展示載體并轉化Yarrowialipolytica［17］，利用菊芋生產檸檬酸，提高了檸檬酸的產量.

非糧作物菊芋是生產燃料乙醇的理想原料之一，但目前尚無滿足工業(yè)化生產的菌種與工藝.本實驗通過過量表達菊粉酶基因，提高了出發(fā)菌株K.marxianus菊粉酶活力，相應地提高了發(fā)酵終點乙醇濃度.本文的結果遠高于文獻［18］報道的克魯維酵母能夠利用菊粉發(fā)酵生產乙醇，乙醇體積分數(shù)達到6%～7%，糖醇轉化效率79.0%～87.4%的結果.為提高終點乙醇濃度，降低發(fā)酵過程中醪液黏度，利用該基因工程菌本實驗室正在開發(fā)新的發(fā)酵工藝，數(shù)據(jù)將另文發(fā)表.

3 結 論

本文以釀酒酵母rDNA結構單元的NTS1至28S（長約3.3kb）DNA片段作為同源重組位點，構建了菊粉酶重組表達載體pFA6a－rDNA－pgk－inu，實現(xiàn)了菊粉酶基因在K.marxianusYX01中的過量穩(wěn)定表達，提高了出發(fā)菌株K.marxianusYX01菊粉酶活力.利用菊芋生料的乙醇發(fā)酵濃度得到提高，剩余殘?zhí)堑臐舛冉档?在菊芋粉濃度為280g／L，總糖濃度為180g／L條件下，發(fā)酵48h，乙醇濃度可達76.5g／L，達到理論轉化率的96%，為我國利用非糧作物菊芋生產燃料乙醇奠定了基礎.

［1］Margaritis A，Bajpai P.Ethanol production fromJerusalemartichoketubers （Helianthustuberosus）usingKluyveromycesmarxianusandSaccharomycesrosei［J］.Biotechnology and Bioengineering，1982，24（4）：941－953.

［2］YUAN Wen－jie，ZHAO Xin－qing，GE Xu－meng，etal.Ethanol fermentation withKluyveromyces marxianusfromJerusalemartichokegrown in salina and irrigated with a mixture of seawater and freshwater［J］.Journal of Applied Microbiology，2008，105（6）：2076－2083.

［3］Ball M M， Raynal A， Guerineau M，etal.Construction of efficient centromeric，multicopy and expression vectors for the yeastKluyveromyces marxianususing homologous elements and the promoter of purine－cytosine－like permease ［J］.Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology，1999，1（2）：347－353.

［4］Bartkeviciute D，Sieksteke R，Sasnauskae K.Heterologous expression of theKluyveromyces marxianusendopolygalacturonase gene （EPG1）using versatile autonomously replicating vector for a wide range of host ［J］.Enzyme and Microbial Technology，2000，26（9－10）：653－656.

［5］Babiker M A，Sanom N，Hisashi H.Random and targeted gene integrations through the control of non－h(huán)omologous end joining in the yeastKluyveromycesmarxianus［J］.Yeast，2010，27（1）：29－39.

［6］Douglas C P，Vineet R，Nancy A，etal.Sequential gene integration for the engineering ofKluyveromycesmarxianus［J］.Journal of Biotechnology，2007，127（3）：408－416.

［7］劉向勇，沈 煜，郭 亭，等.rDNA介導的多拷貝整合表達載體的構建及其在釀酒酵母工業(yè)菌株中的應用［J］.山東大學學報：理學版，2005，40（3）：105－109.LIU Xiang－yong，SHEN Yu，GUO Ting，etal.Construction of a ribosomal DNA multi－copy integration vector and application in the industrialSaccharomycescerevisiaestrain ［J］.Journal of Shandong University：Natural Science，2005，40（3）：105－109.（in Chinese）

［8］葛菁萍，曹喜生，宋 剛，等.木酮糖激酶基因整合表達載體構建及在釀酒酵母中的過表達［J］.微生物學報，2010，50（6）：762－767.GE Jing－ping，CAO Xi－sheng，SONG Gang，etal.Construction of integrative vector for xylulokinase gene and its overexpression inSaccharomyces cerevisiae［J］.Acta Microbiologica Sinica，2010，50（6）：762－767.（in Chinese）

［9］支曉慧，王麗娜，朱 平，等.基于rDNA序列的酵母整合載體的構建及應用 ［J］.中國醫(yī)藥生物技術，2011，6（5）：330－335.ZHI Xiao－h(huán)ui，WANG Li－na，ZHU Ping，etal.Construction and application ofSaccharomyces cerevisiaeintegration vector based on rDNA sequence ［J］.Chinese Medicinal Biotechnology，2011，6（5）：330－335.（in Chinese）

［10］姜 勇，張學成，孫平楠，等.以rDNA為同源重組位點酵母表達鮭魚降鈣素基因多拷貝整合載體的構建［J］.中國海洋大學學報：自然科學版，2009，39（3）：443－447.JIANG Yong，ZHANG Xue－cheng，SUN Ping－nan，etal.Construction of a ribosomal DNA multi－copy integration vector forSaccharomycescerevisiaeexpressing salmon calcitonin ［J］.Periodical of Ocean University of China， 2009，39（3）：443－447.（in Chinese）

［11］唐南筠，霍克克，李育陽.乳酸克魯維酵母高拷貝整合載體的構建及應用［J］.生物化學與生物物理學報，1996，28（5）：540－546.TANG Nan－jun，HUO Ke－ke，LI Yu－yang.The construction and application of the multi－copy integration vector inK.lactis［J］.Acta Biochimica et Biophysica Sinica，1996，28（5）：540－546.（in Chinese）

［12］Klabunde J， Kunze G， Gellissen G，etal.Integration of heterologus genes in several yeast species using vectors containing aHansenula polymorpha－derived rDNA－targeting element ［J］.FEMS Yeast Research，2003，4（4）：185－193

［13］李楠楠，袁文杰，王 娜，等.菊粉酶基因在釀酒酵母中的表達及乙醇發(fā)酵［J］.生物工程學報，2011，27（7）：1032－1039.LI Nan－nan，YUAN Wen－jie，WANG Na，etal.Ethanol fermentation fromJerusalemartichoketubers by agenetically－modifiedSaccharomyces cerevisiaestrain capable of secreting inulinase［J］.Chinese Journal of Biotechnology，2011，27（7）：1032－1039.（in Chinese）

［14］Sambrook J，F(xiàn)ritsch E F，Maniatis T.Molecular Cloning：A Laboratory Manual［M］.2nd ed.New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989.

［15］ZHANG Ling－h(huán)ua，WANG Jing，Ohta Y，etal.Expression of the inulinase gene fromAspergillus nigerinPichiapastoris［J］.Process Biochemistry，2003，38（8）：1209－1212.

［16］ZHANG Ling－h(huán)ua， ZHAO Chang－xin， WANG Jing，etal.Inhibition of glucose on an exoinulinase fromKluyveromycesmarxianusexpressed inPichia pastoris［J］.Process Biochemistry，2005，40（5）：1541－1545.

［17］LIU Xiao－yan，CHI Zhen－ming，LIU Guang－lei，etal.Inulin hydrolysis and citric acid production from inulin using the surface－engineeredYarrowia lipolyticadisplaying inulinase ［J］.Metabolic Engineering，2010，12（5）：469－476.

［18］Duvnjak Z，Kosaric N，Hayes R D.Kinetics of ethanol production fromJerusalemartichokejuice with someKluyveromycesspecies［J］.Biotechnology Letter，1981，3（10）：589－594.