李季文

(甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050)

胡藍(lán)降糖緩釋片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究△

李季文*

(甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050)

目的：建立胡藍(lán)降糖緩釋片的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。方法：采用薄層色譜法對胡藍(lán)降糖緩釋片中絞股藍(lán)進(jìn)行定性鑒別，用高效液相色譜法對胡蘆巴中薯蕷皂苷元進(jìn)行含量測定。結(jié)果：本品定性鑒別薄層色譜特征明顯，專屬性強(qiáng)。采用迪馬SEDEX75-蒸發(fā)光散射檢測器，島津VP-ODS色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，甲醇-水(84∶16)為流動(dòng)相；檢測波長203 nm；流量1.0 mL·min-1；柱溫40 ℃；漂移管溫度85 ℃；氣流體積流量2.5 L·min-1。塔板數(shù)以薯蕷皂苷元計(jì)，不低于2 000。薯蕷皂苷元在0.842～8.42 μg與其色譜峰面積呈良好線性關(guān)系，薯蕷皂苷元平均回收率為98.53%，胡藍(lán)降糖緩釋片在2，4，12 h的釋放量分別在18%～35%，35%～55%，80%以上，均符合規(guī)定。結(jié)論：該法簡便、準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)，可作為胡藍(lán)降糖緩釋片的質(zhì)量控制方法。

胡藍(lán)降糖緩釋片；質(zhì)量控制；薯蕷皂苷元

胡藍(lán)降糖緩釋片系由胡蘆巴、絞股藍(lán)2味中藥組成的片劑，具有益氣養(yǎng)陰的功能，用于治療消渴病。方中胡蘆巴為豆科植物Trigonellafoenum-graecumL.的干燥成熟種子。味苦，性溫，具有溫腎助陽，祛寒止痛的功能。用于腎陽不足，下元虛冷，小腹冷痛，寒疝腹痛，寒濕腳氣[1]。研究證明胡蘆巴各種形式加工物對糖尿病大鼠均有較明顯的降糖作用[2]。絞股藍(lán)Gynostemmapentaphyllum(Thunb.)Makino系葫蘆科(Cucurbitaceae)絞股藍(lán)屬(Gynostemm)多年生草質(zhì)藤本植物[3]?！吨兴幋筠o典》中名為七葉膽，別名小苦藥、遍地生根、五葉參，日本名為甘茶蔓[4]。具有滋補(bǔ)強(qiáng)身，消除疲勞，降脂降壓，防癌抗癌，延年益壽等功能?，F(xiàn)代藥理學(xué)證明絞股藍(lán)具有顯著降血脂、降血糖、平衡血壓、抗癌、抗衰老、保護(hù)肝臟、提高免疫功能等藥理作用[5-7]。在胡藍(lán)降糖緩釋片工藝研究的基礎(chǔ)上，建立了制劑中絞股藍(lán)的薄層色譜定性鑒別方法及薯蕷皂苷元的高效液相測定方法，從而使該產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)一步得到完善和提高。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20AB型高效液相色儀，SIL-20AC自動(dòng)進(jìn)樣器，CTO-20AC柱溫箱，CBM-20A控制器，DGU-20A3脫氣機(jī)，迪馬SEDEX75-蒸發(fā)光散射檢測器，LC solution色譜工作站(日本島津)；BS110電子天平(北京賽多利斯儀器有限公司)；80-1型離心機(jī)(北京機(jī)械儀器維修廠)；R-200旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士布奇)；微波干燥儀(天水華圓制藥設(shè)備有限公司)；HH-601恒溫水浴鍋(金壇市恒豐儀器廠)。

1.2 試藥

胡蘆巴、絞股藍(lán)購自甘肅省黃河藥材市場，經(jīng)甘肅中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院楊錫倉主任中藥師鑒定為正品，胡藍(lán)降糖緩釋片(自制，批號(hào)：20101001，20101002，20101003)，薯蕷皂苷元對照品(中國食品藥品檢定研究院，含量測定用，批號(hào)：110648-200708)，人參皂苷Rg1對照品(中國食品藥品檢定研究院，鑒別用，批號(hào)：110703-200304)，甲醇為色譜純(山東省禹王實(shí)業(yè)有限公司)，三氯甲烷為分析純(煙臺(tái)市雙雙化工有限公司)，其他試劑均為分析純，水為蒸餾水。

2 方法

2.1 絞股藍(lán)薄層色譜鑒別

取本品15片，除去薄膜衣，研細(xì)，置索氏提取器中，加乙醚70 mL，加熱回流提取2 h，棄去乙醚液，取出濾紙筒，晾干。置索氏提取器中，再加甲醇70 mL，加熱回流提取至無色，回收甲醇并濃縮至干。殘?jiān)铀?0 mL溶解，濾過，濾液用水飽和的正丁醇提取5次(25，20，10，10，10 mL)，合并正丁醇液，用氨試液洗滌3次，每次20 mL，棄去氨試液，正丁醇液再用正丁醇飽和的水洗滌3次，每次20 mL，棄去水洗滌液，正丁醇液回收至干，殘?jiān)蛹状? mL溶解，作為供試品溶液。另取人參皂苷Rg1對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。取處方藥品，按優(yōu)選的制備工藝制備缺絞股藍(lán)的緩釋片，按供試品溶液制備陰性對照溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2010年版一部附錄VI B)試驗(yàn)，吸取供試品溶液、對照品溶液、陰性對照溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水(65∶35∶10)10 ℃以下放置12 h的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，于105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。薄層色譜圖見圖1。

1.人參皂苷Rg1 2～5.供試品，6.陰性對照圖1 絞股藍(lán)薄層色譜圖

2.2 薯蕷皂苷元的含量測定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) SEDEX75-蒸發(fā)光散射檢測器，島津VP-ODS色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；甲醇-水(84∶16)為流動(dòng)相；檢測波長203 nm；流量1.0 mL·min-1；柱溫40 ℃；漂移管溫度85 ℃；氣流體積流量2.5 L·min-1。塔板數(shù)以薯蕷皂苷元計(jì)不低于2 000。進(jìn)樣量為20 μL進(jìn)行含量測定。

2.2.2 溶液制備

2.2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取薯蕷皂苷元對照品5.46 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2.2 供試品溶液的制備 取本品10片，除去薄膜衣，研細(xì)，稱取0.5 g，精密稱定，加3 moL·L-1鹽酸溶液20 mL，水浴中加熱水解30 min。取出，放冷，加入三氯甲烷30 mL，加熱回流15 min，用三氯甲烷30 mL，同法處理1次，濾過，再用三氯甲烷30 mL洗滌容器及殘?jiān)?，合并三氯甲烷液，回收三氯甲烷至干，殘?jiān)蛹状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2.3 陰性對照溶液的制備 按處方量稱取絞股藍(lán)，依胡藍(lán)降糖緩釋片制備工藝制成缺胡蘆巴陰性樣品，再按2.2.2.2項(xiàng)下的方法制備緩釋片陰性對照溶液。

2.2.3 專屬性試驗(yàn) 取對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液分別進(jìn)樣，在薯蕷皂苷元相同出峰時(shí)間處，陰性對照溶液色譜不出峰，表明陰性對照不干擾本品測定。結(jié)果見圖2。

A.薯蕷皂苷元對照品 B.胡藍(lán)降糖緩釋片供試品C.缺胡蘆巴陰性樣品圖2 胡藍(lán)降糖緩釋片及對照品HPLC圖

2.2.4 線性關(guān)系考察 精密稱取薯蕷皂苷元對照品，置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，即為對照品儲(chǔ)備液(4.21 mg·mL-1)。精密吸取此儲(chǔ)備液5 mL，置25 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液。精密吸取1，2，4，6，8，10 μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積。以對照品進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行線性回歸?；貧w方程Y=812 991.42X+1 252 792.92，r=0.999 6。結(jié)果薯蕷皂苷元在0.842～8.42 μg與其色譜峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取薯蕷皂苷元對照品溶液10 μL，注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣5次，測得薯蕷皂苷元峰面積積分值，RSD=1.41%。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液10 μL，分別在0，2，4，8，12 h注入液相色譜儀中，測定薯蕷皂苷元峰面積，計(jì)算RSD=2.13%。結(jié)果表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批胡藍(lán)降糖緩釋片粉末6份，平行制備供試品溶液，各取20 μL進(jìn)樣測定，計(jì)算RSD=1.93%(n=6)，表明方法的重復(fù)性較好。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的胡藍(lán)降糖緩釋片粉末(過四號(hào)篩)，精密稱取6份，分別精密加入薯蕷皂苷元對照品溶液0.3 mL，按上述方法測定含量并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 薯蕷皂苷元加樣回收率試驗(yàn)

注：薯蕷皂苷元對照品加入量均為1.21 mg

2.2.9 樣品含量測定 取3批胡藍(lán)降糖緩釋片(批號(hào)：20101001，20101002，20101003)，研細(xì)，按2.2.2.2項(xiàng)下方法制備供試液，精密吸取20 μL，注入液相色譜儀，測定薯蕷皂苷元含量分別為0.47，0.51，0.43 mg·g-1。

2.3 體外釋放度評(píng)價(jià)[8-11]

取緩釋片6片，照釋放度測定法(《中國藥典》2010年版二部附錄XD第一法)，采用溶出度測定裝置，以蒸餾水1 000 mL為溶出介質(zhì)，轉(zhuǎn)速為100 r·min-1，依法操作，經(jīng)1，2，4，6，8，10，12 h取溶液5 mL，濾過，并即時(shí)在操作容器中補(bǔ)充水溶液5 mL，取續(xù)濾液，精密量取5 mL，水浴蒸干，殘?jiān)? moL·L-1鹽酸溶液20 mL(10，5，5 mL)溶解，依次轉(zhuǎn)移至錐形瓶中，水浴中加熱水解30 min。取出，放冷，加入三氯甲烷30 mL，加熱回流15 min，用三氯甲烷30 mL，同法處理1次，濾過，再用三氯甲烷30 mL洗滌容器及殘?jiān)?，合并三氯甲烷液，回收三氯甲烷至干，殘?jiān)蛹状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。供試品與對照品溶液照高效液相色譜法，在203 nm波長處分別測定，計(jì)算出不同時(shí)間的累積釋放度。結(jié)果見表3。

表3 不同時(shí)間薯蕷皂苷元累計(jì)釋放度

由表3可知，本品每片在2，4，12 h的釋放量應(yīng)分別為18%～35%，35%～55%，80%以上，均符合規(guī)定。

3 討論

3.1 溶出介質(zhì)和測定指標(biāo)的選擇

按照釋放度測定法(《中國藥典》2010年版二部附錄X D)和緩控釋制劑試驗(yàn)指導(dǎo)原則(《中國藥典》2010年版二部附錄XIX D)，考察水、pH 6.8的磷酸鹽緩沖液、鹽酸溶液(0.1 moL·L-1)對薯蕷皂苷元釋放度的影響。結(jié)果表明水、pH 6.8的磷酸鹽緩沖液、鹽酸溶液(0.1 moL·L-1)對薯蕷皂苷元的釋放度無顯著影響。因此，選擇水作為溶出介質(zhì)。

3.2釋放度測定方法的確定

胡藍(lán)降糖緩釋片的凝膠骨架材料易吸水膨脹并產(chǎn)生較大的黏性，易粘于杯底，故采用轉(zhuǎn)籃法進(jìn)行測定。用體外釋放度測定方法(轉(zhuǎn)籃法)，轉(zhuǎn)速(100±l)r·min-1，溫度(37±0.5) ℃，蒸餾水1 000 mL為釋放介質(zhì)，于不同時(shí)間點(diǎn)取液5 mL(取液后立即補(bǔ)加5 mL溶出介質(zhì))，微孔濾膜過濾，備用。

3.3 測定波長和輔料干擾試驗(yàn)

取藥粉和輔料，分別在390～190 nm波長掃描。結(jié)果在203 nm處藥粉有最大吸收，輔料無吸收，表明輔料對測定方法無干擾。

3.4 取樣時(shí)間點(diǎn)及釋放量的確定

根據(jù)《中國藥典》2010年版二部緩控釋制劑指導(dǎo)原則關(guān)于取樣時(shí)間點(diǎn)的規(guī)定(第一點(diǎn)0.5～2 h累積釋放率約30%，第二點(diǎn)為中間點(diǎn)的累積釋放率約50%，最后的取樣點(diǎn)累積釋放率為75%)，選擇取樣時(shí)間點(diǎn)為2，4，12 h釋放量分別為18%～35%，35%～55%，80%以上。

3.5 方法評(píng)價(jià)

實(shí)驗(yàn)建立了制劑中絞股藍(lán)的薄層色譜鑒別方法，以薯蕷皂苷元含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用高效液相色譜法SEDEX75-蒸發(fā)光散射檢測器，建立胡藍(lán)降糖緩釋片的含量測定方法，同時(shí)測定了緩釋片的體外釋放度，實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，薄層鑒別及液相色譜方法均簡便、準(zhǔn)確、可靠，可用于控制該制劑的質(zhì)量。

[1] 國家藥典委員會(huì).中國藥典[S].一部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：225-226.

[2] 安福麗，張仲，陳貴銀，等.中藥胡蘆巴的藥理作用研究進(jìn)展[J].中國藥業(yè)，2010，19(4)：63.

[3] 中國植物志編輯委員會(huì).中國植物志[M].第73卷.北京：科學(xué)出版社，1986：265-277.

[4] 江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典[M].上海：上海人民出版社，1977：472.

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[9] 國家藥典委員會(huì).中國藥典[S].二部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄250.

[10] 國家藥典委員會(huì).中國藥典[S].二部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄87.

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StudyonQualityStandardsforHuLanHypoglycemicSustainedReleaseTablets

LI Ji-wen*

(GansuProvinceHospitalofCM，Lanzhou730050，China)

Objective：To establish Hu Lan Hypoglycemic Sustained Release Tablets quality control standard.Methods：TLC qualitative identification method was used to gynostemma in Hu Lan Hypoglycemic Sustained Release Tablets.Using HPLC method for diosgeni determination.Results：This product has apparent feature and strong specificity in qualitative identification of thin layer chromatography.The Dimma SEDEX75-evaporative light scattering detector，island sea VP-ODS (150 mm×4.6 mm，5 μ m)chromatographic column，methanol and water (84∶16)as mobile phase；Detection wavelength is 203 nm，flow rate 1.0 mL·min-1，column temperature 40 ℃；drift tube temperature 85 ℃；airflow volume flow 2.5 L·min-1.Plate hundreds of diosgeni meter，no less than 2 000.Diosgeni in 0.842-8.42 μg range and its chromatographic peak area had good linear relationship，and the average recovery of diosgeni was 98.53%，each piece in 2，4，12 h release quantity respectively in 18%-35%，35%-55%，80% range，which conform to the provisions.Conclusion：The method is simple，accurate，strong specificity and can be used as Hu Lan Hypoglycemic Sustained Release Tablets quality control method.

Hu lan Hypoglycemic SustainedvRelease Tablets；Quality Standards；Diosgeni

2013-02-26)

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甘肅省科技支撐計(jì)劃(090NKCA103)

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李季文，主要研究方向：中藥制劑研究開發(fā)，E-mail：ljwlzh888@163.com