齊敬浩，張桂霞，陳貴林*

(1.內(nèi)蒙古大學 生命科學學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010021;2.內(nèi)蒙古自治區(qū)中蒙藥材規(guī)范化生產(chǎn)工程技術研究中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010021)

中藥科技

白刺果實活性成分提取及其抗氧化活性研究△

齊敬浩1,2，張桂霞1,2，陳貴林1,2*

(1.內(nèi)蒙古大學 生命科學學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010021;2.內(nèi)蒙古自治區(qū)中蒙藥材規(guī)范化生產(chǎn)工程技術研究中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010021)

目的：白刺果實活性成分提取及其抗氧化活性的研究。方法：用70%丙酮提取白刺果實，其提取物依次用乙醚、乙酸乙酯和正丁醇進行萃取得各部分及水相，通過分光光度法測定各部分的黃酮及多酚含量，DPPH法和ABTS法測定各部分的體外抗氧化活性，大孔吸附樹脂結合制備液相法對活性強的水相部分分離純化。結果：水相部分黃酮和多酚含量較高且抗氧化活性最強，分離得到兩個單體化合物，鑒定為異鼠李素-3-O-蘆丁苷和異鼠李素-3-O-蘆丁-7-O-葡萄糖苷，并對兩個單體的抗氧化活性進行測定，兩個單體都有明顯抗氧化活性，且異鼠李素-3-O-蘆丁苷相比于異鼠李素-3-O-蘆丁-7-O-葡萄糖苷清除自由基的能力較強。結論：白刺果實中的黃酮及多酚具有抗氧化活性。

西伯利亞白刺果實；抗氧化；異鼠李素-3-O-蘆丁苷；異鼠李素-3-O-蘆丁-7-O-葡萄糖苷

人體內(nèi)自由基含量隨年齡增長而積累，體內(nèi)清除自由基的各種系統(tǒng)的防御能力逐漸衰退，過多的自由基會導致心、腦、腎等器官功能衰退病變[1]。多酚類和黃酮類是良好的自由基清除劑，水果特別是小漿果富含黃酮等天然酚類活性物質(zhì)成分，具有多種生物活性[2]。Marja P.K等[3]測定了26種漿果的多酚及其抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)不同種漿果所含多酚物質(zhì)不同，均具有良好的抗氧化活性。黃酮類是植物體中普遍存在的多酚類代謝產(chǎn)物，具有很多生物活性，如抗過敏、抗炎、抗氧化、清除自由基和抗突變等作用，且已用來治療糖尿病、癌癥和冠狀動脈性心臟病等[4]。因此，漿果是開發(fā)安全有效的天然抗氧化劑的重要原料。

白刺漿果被美譽為“沙漠櫻桃”，富含生物堿、黃酮類、脂肪酸、氨基酸等生物活性成分[5]，作為重要的蒙藥用于治療腸胃疾病。課題組前期工作中，分別對唐古特白刺果實粗提物抗氧化活性及西伯利亞白刺果實粗提物抑菌活性進行了研究，研究表明其提取物均具有良好的活性[6-7]。本研究利用丙酮勻漿提取法對西伯利亞白刺果實進行提取，通過紫外分光光度法測定各萃取部分的黃酮及多酚含量，并利用體外清除自由基方法(DPPH和ABTS法)測定其體外抗氧化活性。運用大孔吸附樹脂結合制備液相法對活性強的部分進行進一步的分離鑒定，并測定其活性，從而鑒定出主要有效成分，為從白刺果實中開發(fā)天然抗氧化劑提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 材料與試劑

西伯利亞白刺于2010年7月16日采集于內(nèi)蒙古自治區(qū)鄂爾多斯市杭錦旗獨貴塔拉鎮(zhèn)(40°31′N，108°32′E)。經(jīng)內(nèi)蒙古大學陳貴林教授鑒定為西伯利亞白刺NitrariasibiricaPall.。陰干，備用。

DPPH(1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical)、ABTS(2，2′-Azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)diammonium salt)、Trolox(6-hydroxy-2，5，7，8-tetramethychroman-2-carboxylic acid)、福林-酚試劑(Folin-Ciocalteu試劑)和沒食子酸(美國Sigma公司)；乙腈色譜純(美國Spectrum公司)；維生素C、乙醇等試劑均為分析純；色譜柱填料Toyopearl HW-40(東曹株式會社Tosoh，日本)。

1.2 儀器與設備

LC-20A型高效液相色譜儀(日本島津公司)；UV-2450紫外分光光度計(日本島津公司)；Heidolph旋轉蒸發(fā)儀(德國海道夫公司)；超導核磁共振(SC-NMR)Varian INOVA AS 600(Varian，美國)；電噴霧質(zhì)譜儀為Bruker amaZon ETD電噴霧離子阱質(zhì)譜儀(Bruker，德國)。

2 方法

2.1 白刺果實活性成分的提取與分離

取干燥果實100 g，70%丙酮勻漿提取(料液比：1∶3；提取次數(shù)：3次；提取時間：各0.5 h)，提取物合并后40 ℃真空旋轉蒸發(fā)濃縮至300 mL。抽濾得沉淀，濾液依次用乙醚、乙酸乙酯和正丁醇分別萃取3次，每次300 mL。合并，真空旋轉蒸發(fā)，干燥，得各萃取部分及水相。西伯利亞白刺果實70%丙酮提取物順相液相圖譜見圖1。將水相過AB-8大孔吸附樹脂，用不同濃度甲醇依次洗脫，得40%和60%甲醇部分，真空蒸發(fā)，干燥。將兩部分分別經(jīng)Toyoperal柱分離，用70%乙醇洗脫得到化合物1和2。

圖1 西伯利亞白刺果實70%丙酮提取物順相液相圖譜

2.2 多酚含量測定

白刺果實丙酮粗提物和各萃取部分的總多酚含量的測定采用福林酚法(Folin-Ciocalteau colorimetric method)[8]。以沒食子酸作為反應底物制作標準曲線，標準曲線方程為Y=0.036X-0.000 6(r=0.999 7)，Y為吸光度值，X為沒食子酸濃度。

2.3 黃酮含量的測定

取白刺果實各萃取部分10 mg，溶于25 mL容量瓶中，配成濃度為0.4 mg·mL-1的溶液，精密量取對照溶液1，2，3，4，5，6 mL分別置于25 mL容量瓶中，各加30%乙醇至6.0 mL，加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，混勻6 min，再加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻6 min，加氫氧化鈉試液10 mL，再加30%乙醇至刻度線，搖勻，放置15 min，以不加氫氧化鈉為對照，在500 nm紫外光下測定吸光度值，以蘆丁為對照品，繪制標準曲線。標準曲線方程為Y=12.95X-0.027(r=0.999)，X為蘆丁濃度，Y為吸光度值。

2.4 抗氧化活性的測定

2.4.1 白刺果實萃取物清除自由基DPPH的測定 通過測定清除DPPH自由基的能力來測定抗氧化性[9]。配制濃度為1×10-6mol·L-1的DPPH甲醇溶液，取1 mL該溶液與3 mL不同濃度的樣品溶液(160，120，80，40，20，0 mg·mL-1)輕輕混勻，室溫反應30 min，于517 nm處測定反應物的吸光度。以維生素C為對照。樣品清除能力用所加樣品較空白對照的DPPH吸光度的降低來表示。樣品抑制百分率按公式計算。

抑制率(%)=(1-AA/AB)×100。

式中：AA為加樣品后DPPH吸光度，AB為空白對照的吸光度。IC50表示能夠清除50%自由基所需的樣品濃度。IC50從樣品清除率的線性曲線計算可得。

2.4.2 清除ABTS自由基能力的測定 清除ABTS自由基能力測定參考Re等[10]的方法，計算每分子抗氧化物質(zhì)捕捉ABTS自由基的數(shù)目(TEAC值)。Trolox標準曲線方程為Y=4.096 0X+8.961 0，(r=0.992 1)，Y為消除率(inhibition)，X為濃度。

2.5 數(shù)據(jù)分析

3 結果

3.1 白刺果實丙酮提取物及各萃取部分多酚及黃酮含量

采用70%丙酮水溶液提取干燥的西伯利亞白刺果實，丙酮粗提物及各萃取部分的多酚含量用每克干重的提取物中含有多少毫克的沒食子酸來表示。從表1可以看出，乙醚萃取物多酚含量最高，其次為乙酸乙酯、正丁醇和水相部分，而黃酮類化合物含量高低依次為乙醚、乙酸乙酯、正丁醇和水相部分，沉淀含量最低。其中乙醚萃取物多酚和黃酮類化合物含量最高，但是乙醚萃取部分得率(0.67%)比較低，不適合進一步進行分離提取。

表1 白刺果實丙酮粗提物及各萃取部分的多酚含量和TEAC

3.2 各萃取部分抗氧化活性測定

從表1可以看出，在4種萃取物中，乙醚萃取物的活性最強，為(5.68±0.14)mmol·L-1，是維生素C的0.4倍，其次是水相(4.13±0.24)mmol·L-1，乙酸乙酯的清除能力緊隨其后，沉淀的活性最弱。

由圖2可見，DPPH法與ABTS法測定結果類似。乙醚萃取物比其他部分的抗氧化活性強，隨著濃度增大而上升，當濃度為90 μg·mL-1時，自由基清除率達到最大的77.37%，此后隨濃度的增加自由基清除率變化不大。水相部分濃度大于30 μg·mL-1時，自由基清除率隨著濃度增加迅速上升，當濃度達到120 μg·mL-1時，自由基清除率接近于乙醚部分，達到最大的78.31%。乙酸乙酯萃取物清除自由基率與濃度呈良好的線性關系(r=0.979 7)。正丁醇萃取物對自由基清除率接近于乙酸乙酯萃取物，沉淀的清除自由基能力最弱，且隨濃度變化不大。因此，水相部分有較多的多酚和黃酮類化合物，抗氧化能力較強，且該部分得率較高(17.1%)，適合進一步對其進行分離提取主要有效成分。

圖2 不同濃度白刺果實提取物DPPH自由基清除率

3.3 兩個化合物的分離鑒定

對主要活性部位利用大孔吸附樹脂結合制備液相法對活性強的部分進一步分離純化，得到兩個主要的單體化合物，鑒定分析并對兩個化合物的抗氧化活性進行評價。

化合物1：黃色粉末，1H-NMR(400 MHz，acetone-d6+D2O)圖譜中槲皮素的H信號(δ 6.21，6.41，7.05，7.68，7.72)，甲氧基上H信號為(δ 3.93)。13C-NMR(151 MHz，acetone-d6+D2O)圖譜中共發(fā)現(xiàn)有28個碳信號，15個構成槲皮素骨架結構，12個構成兩個六碳糖，1個形成為甲氧基碳。依據(jù)化學位移及耦合常數(shù)推斷，其中一個為β葡萄糖(H-1的耦合常數(shù)為7.8 Hz)，另一個為鼠李糖。葡萄糖6號碳化學位移向低場移動，推測鼠李糖與葡萄糖1～6位相連，此苷元應該為蘆丁苷。HMBC圖譜中，鼠李糖H-6″′(δ 1.10)與葡萄糖C-1″(δ 105.3)相連，葡萄糖端基氫(δ 5.1)與槲皮素骨架C-3(δ 136.6)相連，推斷蘆丁糖上3號C與骨架相連。另外，甲氧基氫(δ 3.93)與C-3′(δ 152.5)相連。結合以上數(shù)據(jù)分析并與文獻值[11]比較，推斷化合物1為異鼠李素-3-O-蘆丁苷Isorhamnetin-3-O-rutinoside(narcissin)(見圖3)。

化合物2：黃色粉末，該化合物為含1個葡萄糖、1個蘆丁的異鼠李素苷。HMBC圖譜中，鼠李糖H-6″′(δ 1.10)與葡萄糖C-1″(δ 103.20)相連，葡萄糖端基氫(δ 5.13)與槲皮素骨架C-3(δ 136.76)相連，推斷蘆丁糖在C-3與骨架相連[12]。另一個葡萄糖的端基氫(δ 5.21)與C-7(δ 165.59)相連，由此可知該葡萄糖連接在C-7位置。與文獻[13]比較，推測該化合物為異鼠李素-3-O-蘆丁-7-O-葡萄糖苷Isorhamnetin-3-O-rutinoside-7-O-glucoside(見圖3)。

兩個單體化合物的抗氧化活性用TEAC值表示，由表1可見，抗氧化能力要比其他所有部分都要強，與對照維生素C的抗氧化能力相當，但是異鼠李素-3-O-蘆丁苷要比異鼠李素-3-O-蘆丁-7-O-葡萄糖苷抗氧化能力強。

化合物1：R1=rutin，R2=H；Isorhamnetin-3-O-rutinoside化合物2：R1=rutin，R2=glc；Isorhamnetin-3-O-rutinoside-7-O-glucoside圖3 異鼠李素-3-O-蘆丁苷(化合物1)和異鼠李素-3-O-蘆丁-7-O-葡萄糖苷(化合物2)化學結構

4 討論

許多研究表明，酚類物質(zhì)是蔬菜、水果中的主要抗氧化成分[14]。因此本研究中我們利用ABTS和DPPH兩種方法對西伯利亞白刺果實各萃取部分抗氧化能力進行了測定，并對每一萃取部分所含的多酚含量與黃酮含量進行了測定。發(fā)現(xiàn)在各萃取物中，乙醚萃取物多酚含量和黃酮類物質(zhì)最高，抗氧化活性最強，水相次之，沉淀最弱。其中水相部分多酚含量沒有乙酸乙酯和正丁醇萃取物含量高，但其清除自由基活性明顯高于這兩部分，這可能是因為水相部分中包含其他高極性非多酚類的化合物。

Katalinic等[15]通過對70種藥用植物總酚和總抗氧化能力FRAP的比較，發(fā)現(xiàn)抗氧化活性與總酚含量有極顯著的相關性，且相關系數(shù)為0.982 5。而本研究結果顯示多酚含量與抗氧化能力存在相關關系，但是相關性不高，這可能是由于植物中的各種天然抗氧化成分之間往往具有協(xié)同增效作用，如維生素C可能會對多酚物質(zhì)的抗氧化活性產(chǎn)生間接影響，這與之前報道的總多酚含量與其抗氧化活性并非直接相關是一致的[16]。黃酮類化合物清除自由基的最主要機制是通過酚羥基與自由基反應生成較穩(wěn)定的半醌式自由基，從而終止自由基鏈式反應，本研究卻未發(fā)現(xiàn)黃酮類含量與抗氧化能力存在相關性，可能是與作者所采用抗氧化指標體系不同有關。

本研究利用大孔吸附樹脂結合制備液相法對抗氧化活性強的水相部分進行進一步的分離鑒定，初步分離出兩個單體，異鼠李素-3-O-蘆丁苷和異鼠李素-3-O-蘆丁-7-O-葡萄糖苷。史天星等[17]曾對遠志地上部分10種黃酮類成分進行分離及抗氧化活性測定，發(fā)現(xiàn)其中6種黃酮類成分具有明顯抗氧化活性，異鼠李素-3-O-β-D-吡喃半乳糖苷和異鼠李素活性最強。課題組對這兩個化合物進行了抗氧化能力的測定，發(fā)現(xiàn)也具有很強的清除自由基能力，相比于其他槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷和槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷等活性要強。Boubaker等[18]對異鼠李素-3-O-蘆丁苷的抗癌細胞進行了測定，發(fā)現(xiàn)異鼠李素-3-O-蘆丁苷可以誘導慢性粒細胞白血病(K562)細胞凋亡。因此，這兩種單體化合物相比于各萃取粗提部分都有更強清除自由基的能力，這兩種化合物提取率較高，抗癌和抗氧化的作用明顯，具有開發(fā)利用價值。

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ResearchonActiveComponentExtractionofNitrariasibiricaPall.FruitandTheirAntioxidantActivity

QI Jing-hao，ZHANG Gui-xia，CHEN Gui-lin*

(CollegeofLifeScience，InnerMongoliaUniversity，Hohhot010021，China)

Objective：Research on active component extraction ofNitrariasibiricaPall.fruit and their antioxidant activity.Methods：Fruits ofNitrariasibiricaPall.were extraced by 70% acetone，then ether，ethyl acetate and n-butanol successively.The contents of flavonoid and total polyphenol in each fraction were determined by UV spectrophotometry，the antioxidant activity of each fraction were determined based on the method of DPPH and ABTS which can evaluate the ability of in vitro antioxidant.The crude extract of water fraction was separated and purificated by combined use of macroporous resin and preparative HPLC.Results：Water fraction had the highest antioxidant activity and relatively high content of flavonoid and total polyphenol，we isolated two monomer compounds，the compounds were determined to be isorhamnetin-3-O-rutinoside and isorhamnetin-3-O-rutinoside-7-O-glucoside by HNMR and the antioxidant activity of these two monomer compounds were determined.The result showed that both of the two monomer compounds have obvious antioxidant activity，and in vitro anti-oxidant ability of isorhamnetin-3-O-rutinoside is higher than isorhamnetin-3-O-rutinoside-7-O-glucoside.Conclusion：The flavonoid and polyphenol ofNitrariasibiricaPall.fruit have high antioxidant activity.

NitrariasibiricaPall.fruit；Antioxidant activity；Isorhamnetin-3-O-rutinoside；Isorhamnetin-3-O-rutinoside-7-O-glucoside

2013-03-29)

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國家科技支撐計劃項目(2011BAI07B07)，內(nèi)蒙古科技創(chuàng)新引導獎勵資金項目(2010)

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陳貴林，教授，博士生導師，研究方向：藥用植物化學，E-mail：guilinchen61@163.com