劉 建，湯德元，曾智勇，羅險峰，李春燕，甘振磊，王 鳳，郝 飛

（1．貴州大學動物科學學院，貴州 貴陽550025；2．貴州省動物疫病預防控制中心，貴州 貴陽550008）

筆者于2011年2月對發(fā)生在貴州省某豬場發(fā)生的豬繁殖與呼吸綜合征病毒和副豬嗜血桿菌混合感染的疫情進行了診治，結(jié)果報告如下。

1 發(fā)病情況

2011年2月，貴州某豬場6周齡仔豬共有120頭，未免疫豬繁殖與呼吸綜合征疫苗，從第1例具有明顯癥狀的仔豬發(fā)病1周內(nèi)，共計有30頭仔豬發(fā)病，其中死亡5頭，發(fā)病率25%，死亡率16．7%。發(fā)病后豬場曾使用紅霉素和鏈霉素等抗生素進行治療，病豬體溫略有降低，但效果不佳，疫情不斷蔓延。

2 臨床癥狀

發(fā)病豬表現(xiàn)為精神抑郁，被毛零亂，消瘦，體溫升至41℃左右，咳嗽，嘔吐，疼痛（尖叫），眼瞼水腫，可視黏膜發(fā)紺，膝關(guān)節(jié)腫大，跛行，肌肉震顫，耳朵和兩后腿之間腹部皮膚有大量的藍紫色斑點。

3 剖檢病理變化

剖檢瀕死期仔豬6只，打開胸腔可見大量黃色積液，腹膜和胸膜有漿液性和化膿性纖維素性滲出物，肺部水腫、有針尖大小的出血點，肝臟、脾臟表面覆蓋纖維素性滲出物，心肌蒼白、變軟，心包內(nèi)有大量淡黃色積液，脾臟稍腫大，邊緣有壞死灶，腎呈蒼白色或土黃色、變軟，剖開后有黃色積液滲出，個別腎臟有出血點，胃黏膜脫落并且有出血點，腸系膜淋巴結(jié)和腹股溝淋巴結(jié)充血、水腫，用手術(shù)刀切開四肢關(guān)節(jié)可見腔內(nèi)混有大量絮狀物的黃色積液。

4 診斷

4．1 臨床診斷

通過對豬場發(fā)病情況、臨床癥狀和剖檢變化診斷該豬場疑似豬繁殖與呼吸綜合征病毒和副豬嗜血桿菌混合感染。

4．2 實驗室診斷

4．2．1 豬繁殖與呼吸綜合征的確診 按照豬繁殖與呼吸綜合征病毒RT－PCR檢測試劑盒（北京世紀元亨動物防疫技術(shù)有限公司生產(chǎn)）說明書處理采集的10份病死仔豬淋巴結(jié)、腎臟、脾臟、肺臟和肝臟等病料，然后提取病毒總RNA，進行RT－PCR擴增。RT－PCR反應體系如下：16．8μL RT－PCR 反應液（用前混勻），1．2μL酶混合液，2μL模板RNA，總體積20μL。RT－PCR反應條件：42℃45min，94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，35個循環(huán)；72℃延伸7min。瓊脂糖凝膠電泳后，10份病料均出現(xiàn)了PRRSV陽性條帶，大小均為200bp（圖1），與預期目的條帶大小相符，這說明采集的10份病料中均存在PRRSV，且陽性率為100%，同時設(shè)立陰陽性對照。

圖1 病料RT－PCR擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果

4．2．2 副豬嗜血桿菌的確診

4．2．2．1 細菌分離、培養(yǎng)特性和菌落形態(tài)觀察 將采集的病料分別接種在含0．05%煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）和5%馬血清的TSA培養(yǎng)基、普通瓊脂培養(yǎng)基和鮮血瓊脂培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)24～48h，結(jié)果該細菌在普通瓊脂培養(yǎng)基上不生長；在鮮血瓊脂培養(yǎng)基上生長不良；而在TSA培養(yǎng)基生長良好，可見細菌菌落呈露珠狀、針尖大小、光滑濕潤、淡藍色，直徑約0．5mm左右。取純培養(yǎng)36h的菌落涂片革蘭染色，光學顯微鏡下觀察為革蘭陰性細小短桿菌，個別呈兩極濃染的球桿狀。

4．2．2．2 衛(wèi)星現(xiàn)象檢查 取兩個TSA培養(yǎng)基，一個劃線接種上述分離菌的單菌落并點種金黃色葡萄球菌，另一個培養(yǎng)基則只劃線接種上述分離菌的單菌落作為對照，37℃恒溫培養(yǎng)24～48h后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在葡萄球菌旁邊有可疑的副豬嗜血桿菌生長，而且離金黃色葡萄球菌越近菌落越大越多，越遠菌落越小且逐漸稀疏，甚至不生長，表現(xiàn)出明顯的“衛(wèi)星現(xiàn)象”。

4．2．2．3 生化特性鑒定 將細菌純培養(yǎng)物分別接種于葡萄糖、蔗糖、半乳糖、麥芽糖、D－核糖、吲哚、脲酶、D－甘露醇、硫化氫、賴氨酸、氧化酶、靛基質(zhì)等微量生化反應管，37℃培養(yǎng)24～48h后，可見該分離菌對葡萄糖、蔗糖、半乳糖、麥芽糖、D－核糖反應呈陽性；對其他7種物質(zhì)反應為陰性。鑒定結(jié)果與副豬嗜血桿菌的生化特性相符合［1］。

4．2．2．4 PCR檢測 根據(jù)副豬嗜血桿菌OMP5基因序列（GenBank登錄號：HM172038），用生物軟件Premier Primer 5．0 設(shè)計1對特異性引物，擴增副豬嗜血桿菌OMP5的全基因，由TaKaRa公司合成。上游引物P1：5′－ATGAAAAAATCTTTAATTGCA－3′；下游引物 P2；5′－TTACATAGAAACTTCTTTTGAACC－3′，預計擴增大小1 113bp。采用裂解法提取DNA，PCR反應條件：94℃3min；94℃30s，57℃30s，72℃1min 30s，共35個循環(huán)；72℃5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1．2%瓊脂糖凝膠電泳可見1 113bp的條帶（圖2），與預期大小相符，說明病料中存在副豬嗜血桿菌。

圖2 副豬嗜血桿菌PCR擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果

4．2．2．5 藥物敏感試驗 用臨床上常用的12種抗生素對分離的副豬嗜血桿菌進行藥物敏感性試驗，結(jié)果該分離的副豬嗜血桿菌對氨芐青霉素、頭孢噻吩、阿莫西林、氧氟沙星和環(huán)丙沙星高度敏感；對慶大霉素、新霉素和卡那霉素中度敏感；對鏈霉素、紅霉素、潔霉素和四環(huán)素耐藥。

5 治療和預防

根據(jù)藥敏試驗結(jié)果，采取如下治療措施：患病豬全部隔離飼養(yǎng)，注射豬繁殖與呼吸綜合征病毒高免血清和氨芐青霉素治療；病死豬及污染物焚燒或深埋，對污染的圈舍和四周環(huán)境進行嚴格消毒；未發(fā)病豬則緊急接種豬繁殖與呼吸綜合征疫苗，同時加強飼養(yǎng)管理。治療和藥物預防后，病豬病情明顯好轉(zhuǎn)，呼吸困難、高熱等癥狀消退，病情得到有效控制。

［1］ 東秀珠．常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊［M］．北京：科學出版社，2001：125．