徐 琪，陳 陽(yáng)，黃正洋，張 揚(yáng)，李欣玉，甑 霆，李 秀，段修軍，陳國(guó)宏

（1．江蘇省動(dòng)物遺傳繁育與分子設(shè)計(jì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 揚(yáng)州225009；2．江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江西 南昌330045；3．國(guó)家水禽種質(zhì)資源基因庫(kù)，江蘇 泰州225300）

DNA甲基化是真核細(xì)胞基因組主要表觀遺傳修飾方式之一，是調(diào)節(jié)基因組功能的重要手段，在基因表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞分化、腫瘤發(fā)生、染色質(zhì)變構(gòu)、轉(zhuǎn)座子失活、基因沉默等生物過程中起著重要作用［1］。近年來(lái)，DNA甲基化研究取得了突飛猛進(jìn)的進(jìn)展，目前已深入到生物、醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)以及環(huán)境等各個(gè)領(lǐng)域。但越來(lái)越多的研究表明，人們更為關(guān)注的是某一個(gè)或某幾個(gè)特定基因DNA甲基化研究［2－4］，而從全基因組的研究較少，在畜禽僅見豬、雞上見有報(bào)道［5－6］。

DNA甲基化不僅影響到基因的表達(dá)，還會(huì)影響到性狀的表達(dá)［7－8］。目前已知，DNA甲基化與疾病的發(fā)生密切相關(guān)，甲基化狀態(tài)的改變是致病作用的一個(gè)關(guān)鍵因素，它包括基因組整體甲基化水平降低和CpG島局部甲基化程度的異常升高，這將導(dǎo)致基因組的不穩(wěn)定（如染色體的不穩(wěn)定、可移動(dòng)遺傳因子的激活、易感基因的表達(dá)）。本試驗(yàn)以金定鴨、櫻桃谷北京鴨、番鴨、半番鴨（番鴨♂×金定鴨♀、番鴨♂×櫻桃谷北京鴨♀）為試驗(yàn)材料，應(yīng)用Methyl－Flash整體甲基化定量試劑盒檢測(cè)金定鴨、櫻桃谷北京鴨與番鴨及其雜交后代基因組甲基化程度的差異，并分析基因組整體甲基化水平與免疫性狀的關(guān)系，以期探明半番鴨及其親本基因組整體DNA甲基化對(duì)部分免疫性狀的影響。

1 材料與方法

1．1 試驗(yàn)材料 試驗(yàn)鴨均由國(guó)家水禽種質(zhì)資源基因庫(kù)（江蘇泰州）提供，隨機(jī)選擇同批出雛，健康的金定鴨、櫻桃谷北京鴨、番鴨、金番鴨（番鴨♂×金定鴨♀）、櫻番鴨（番鴨♂×櫻桃谷北京鴨♀），各20只，飼養(yǎng)管理?xiàng)l件相同，按正常免疫程序免疫。10周齡時(shí)，采集EDTA抗凝血5mL，其中3mL用于淋巴細(xì)胞分離，2mL用于血清分離。

1．2 免疫指標(biāo)的測(cè)定 分離后血清，按照全自動(dòng)生化分析儀（日立7170A型）及試劑盒使用說明書（上海北加生化試劑有限公司）進(jìn)行免疫指標(biāo)的測(cè)定，總蛋白、球蛋白采用終點(diǎn)法，IgA、IgM、IgG采用免疫透射比濁法。

1．3 外周血淋巴細(xì)胞的分離與DNA提取 利用淋巴細(xì)胞分離液（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司），采用密度梯度離心法（Ficoll）分離外周血單核細(xì)胞（PBMCs），采用細(xì)胞基因組DNA快速抽提試劑盒（上海華舜生物技術(shù)有限公司）提取分離細(xì)胞的DNA。

1．4 DNA整體甲基化水平檢測(cè) 采用 Methyl－Flash整體甲基化定量試劑盒（Epigentek公司，美國(guó)）檢測(cè)，操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行，酶標(biāo)儀上450nm處讀取吸光度值，計(jì)算DNA甲基化水平。

1．5 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS11．5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間顯著性檢驗(yàn)采用麥角新堿（LSD）法多重比較，相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2．1 DNA整體甲基化水平檢測(cè)結(jié)果 5個(gè)鴨群體DNA整體甲基化水平檢測(cè)結(jié)果見表1。兩個(gè)遠(yuǎn)緣雜交種（番鴨♂×金定鴨♀、番鴨♂×櫻桃谷北京鴨♀）的DNA整體甲基化程度顯著高于或極顯著高于親本（金定鴨、櫻桃谷北京鴨、番鴨），而3個(gè)親本間以及兩個(gè)遠(yuǎn)緣雜交種間差異不顯著（P＞0．05）。

表1 5個(gè)鴨群體DNA整體甲基化水平

2．2 鴨免疫性狀測(cè)定結(jié)果 對(duì)金定鴨、櫻桃谷北京鴨、番鴨、金番鴨和櫻番鴨的總蛋白、球蛋白、IgA、IgM和IgG部分免疫性狀進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表2。

表2 5個(gè)鴨群體部分免疫性狀的測(cè)定結(jié)果 ±SD）

表2 5個(gè)鴨群體部分免疫性狀的測(cè)定結(jié)果 ±SD）

群體 n 總蛋白（g／L） 球蛋白（g／L） IgA（g／L） IgM（g／L） IgG（g／L）金定鴨 20 49．05±3．00a 29．17±2．28a 0．17±0．05ab 0．24±0．10ac 0．30±0．09a櫻桃谷北京鴨 20 47．38±8．97ac 29．10±6．44a 0．20±0．07a 0．25±0．13a 0．16±0．06b番鴨 20 45．42±2．83bc 26．44±2．06b 0．15±0．10b 0．21±0．10aef 0．12±0．06c番鴨♂×金定鴨♀ 20 42．60±4．83bd 23．98±3．18c 0．14±0．03b 0．16±0．05be 0．07±0．02d番鴨♂×櫻桃谷北京鴨♀ 20 39．98±3．71d 22．67±2．37c 0．14±0．03b 0．17±0．07bcf 0．07±0．02cde

由表2可以看出，所有免疫指標(biāo)大致表現(xiàn)為家鴨高于番鴨，番鴨高于半番鴨；除IgG外，金定鴨與櫻桃谷北京鴨其他4項(xiàng)免疫指標(biāo)間差異不顯著（P＞0．05）；兩種半番鴨間5項(xiàng)免疫指標(biāo)間差異不顯著（P＞0．05），且絕大多數(shù)性狀均顯著低于金定鴨和櫻桃谷北京鴨（P＜0．05）。

2．3 鴨基因組整體DNA甲基化水平與部分免疫性狀的關(guān)系 鴨基因組整體DNA甲基化程度與部分免疫性狀相關(guān)性統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表3和圖1～5。

由表3和圖1～5可以看出，鴨基因組整體DNA甲基化水平與免疫性狀間呈負(fù)相關(guān)，其中與總蛋白、球蛋白和IgM相關(guān)達(dá)顯著或極顯著水平。

表3 鴨DNA整體甲基化水平與部分免疫性狀的關(guān)系

圖1 鴨DNA整體甲基化水平與總蛋白關(guān)系

圖2 鴨DNA整體甲基化水平與球蛋白關(guān)系

圖3 鴨DNA整體甲基化水平與IgA關(guān)系

圖4 鴨DNA整體甲基化水平與IgM關(guān)系

圖5 鴨DNA整體甲基化水平與IgG關(guān)系

3 討論

本試驗(yàn)采用比色法，利用MethylFlash甲基化DNA定量試劑盒檢測(cè)了鴨全基因組的5－mC，該方法能高度特異的識(shí)別5－mC，而不會(huì)與未甲基化的胞嘧啶結(jié)合，與基于套色板的方法相比（比如高效液相色譜儀（HPLC）或者質(zhì)譜）相比，結(jié)果更精確可靠，也更穩(wěn)定。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)半番鴨及其親本的基因組甲基化從1．2%到2．1%不等。一般認(rèn)為在脊椎動(dòng)物基因組中有3%的C是甲基化的，也有人認(rèn)為在脊椎動(dòng)物基因組內(nèi)相鄰的二核苷酸CpG的含量為20%，而CpG中70%的C是甲基化的，即1．4%的C是甲基化［9］，這與本試驗(yàn)結(jié)果是一致的。當(dāng)然，基因組甲基化程度還與所檢測(cè)的組織與細(xì)胞有關(guān)系，梁秋菊等人［10］研究發(fā)現(xiàn)，在豬肌肉基因組甲基化要顯著高于血液DNA甲基化含量，本試驗(yàn)主要對(duì)外周血淋巴細(xì)胞基因組甲基化進(jìn)行了檢測(cè)，而淋巴細(xì)胞包含有T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞等多種細(xì)胞［11］，這可能多少對(duì)試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生一定的影響。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)半番鴨的甲基化含量高于親本，而免疫性狀表型值卻低于親本，這表明在雜種形成過程中某些位點(diǎn)發(fā)生了甲基化作用，或者說雜種利用甲基化關(guān)閉了一些抗性基因的有效表達(dá)。試驗(yàn)研究證實(shí)，雜種將兩個(gè)不同的基因群組合在一起形成的不同于親本的新的遺傳體系，新的遺傳體系不僅僅是所得遺傳物質(zhì)的簡(jiǎn)單組合，而是經(jīng)歷了復(fù)雜的調(diào)整過程，產(chǎn)生了一種不同于親本的遺傳與表觀遺傳信息。在新的體系中，親本的基因型彼此協(xié)調(diào)、相互促進(jìn)、有效地控制基因的表達(dá)，雜種在新的遺傳體系中產(chǎn)生了不同于親本品種的性狀表現(xiàn)，這也就是半番鴨免疫性狀表型值普遍低于親本主要原因。本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)鴨基因組整體DNA甲基化水平與免疫性狀間呈負(fù)相關(guān)，這主要是由于DNA甲基化程度越高，基因表達(dá)受到抑制，其表型值也相應(yīng)較低。

［1］ Trygve O Tollefsbol．Epigenetics Protocols［M］．Totowa New Jersey：Humana Press，2004．

［2］ Ying Yu，Huanmin Zhang，F(xiàn)ei Tian，etal，Quantitative Evaluation of DNA Methylation Patterns for ALVE and TVB Genes in a Neoplastic Disease Susceptible and Resistant Chicken Model［J］．PLoS ONE，2008，3（3）：1－10．

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［10］梁秋菊，劉麗娜，彭健，等．豬血液和肌肉組織DNA甲基化含量的測(cè)定［J］．中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，40（8）：1774－1779．

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