屠 迪，鄔 靜，袁莉蕓，文利新，2

（1．湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙410128；2．長沙綠葉生物科技有限公司，湖南 長沙410128）

當(dāng)前畜牧生產(chǎn)中集約化養(yǎng)殖，飼養(yǎng)密度較高，動物運(yùn)動量減少，高能量日糧，疫病的流行及飼料添加劑和治療藥物的毒副作用等不良因素都對動物體的能量代謝有不利影響。長期高能量攝入會引起動物肝內(nèi)多種脂類的蓄積［1－3］，包括甘油三酯（TG）、膽固醇和游離脂肪酸（FFA）等［4］，大量的FFA則具直接的細(xì)胞毒性，進(jìn)而引起肝細(xì)胞代謝功能失調(diào)和凋亡［5］。當(dāng)肝細(xì)胞脂肪變性時，凋亡細(xì)胞數(shù)量增加，并可出現(xiàn)血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）升高等生化指標(biāo)變化。因此有學(xué)者將FFA在非脂肪組織中過度沉積引起脂代謝異常而造成的損傷稱為脂毒性（Lipotoxicity）；上述過程所引起的細(xì)胞凋亡，稱為脂凋亡（Lipoapotosis）［6－7］。當(dāng)肝臟發(fā)生脂損傷時會影響肝臟及全身各臟器各種功能生理機(jī)能并造成機(jī)體代謝紊亂，影響動物的繁殖性能和肉品品質(zhì)，并使動物抗應(yīng)激能力、免疫能力下降等容易受到致病因素影響，容易引發(fā)疾病。本文以軟脂酸（Palmitic acid，PA）對人肝細(xì)胞L02細(xì)胞進(jìn)行處理誘導(dǎo)其發(fā)生脂凋亡，并對此過程中Caspase3與Caspase9信號的作用進(jìn)行研究，從而對脂凋亡發(fā)生機(jī)制進(jìn)行探索。

1 材料與方法

1．1 材料 人L02肝細(xì)胞系，購自中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心；RPMI1640培養(yǎng)基為GIBCO產(chǎn)品；胎牛血清（FBS）為杭州四季青公司產(chǎn)品；兔抗人Caspase3抗體貨號sc－8355和兔抗人Caspase 9抗體貨號Sc－1226為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；兔抗人β－actin抗體貨號bs－0061R為北京博奧森生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；總蛋白試劑盒，貨號A006由南京建成生物工程研究所生產(chǎn)；AV／PI流式細(xì)胞檢測試劑盒由Invitrogen公司生產(chǎn)。

1．2 試驗(yàn)分組 L02細(xì)胞系的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為含有10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基，軟脂酸（Palmitic acid，PA）的助溶劑為DMSO終濃度為0．5%。試驗(yàn)細(xì)胞共分4組，L02細(xì)胞以4×104細(xì)胞／mL密度傳代培養(yǎng)24h后更換培養(yǎng)基并按照表1所示加入PA，并繼續(xù)在37℃5%CO2的條件下培養(yǎng)24h以進(jìn)行后續(xù)檢測。

表1 L02脂肪變性模型分組

1．3 細(xì)胞凋亡檢測 試驗(yàn)采用DAPI染色通過形態(tài)學(xué)對凋亡進(jìn)行鑒定，并采用AV／PI雙染后流式細(xì)胞檢測為細(xì)胞凋亡提供一步的證據(jù)。

1．4 Caspase3與Caspase9檢測 常規(guī) Western blot操作步驟檢測Caspase3與Caspase9，重復(fù)3次進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2．1 細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果 DAPI是一種可以和雙鏈DNA結(jié)合的染料，與DNA結(jié)合后可以產(chǎn)生比DAPI自身強(qiáng)20多倍的熒光并以此區(qū)別凋亡細(xì)胞。DAPI染色結(jié)果（圖1）顯示，未添加PA的對照組低倍鏡下觀察，幾乎未見濃染的細(xì)胞核，軟脂酸處理后視野中高亮、變形、腫脹等異常形態(tài)細(xì)胞核清晰可見。對濃染的細(xì)胞核進(jìn)行計(jì)數(shù)后發(fā)現(xiàn)，發(fā)生細(xì)胞核濃染（“→”所示）的細(xì)胞數(shù)量隨PA劑量的增加而增多。高倍鏡下顯示大量的細(xì)胞核呈現(xiàn)波紋狀或呈折縫樣外觀，部分染色質(zhì)出現(xiàn)濃縮狀態(tài)，僅有少數(shù)的細(xì)胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體。這一結(jié)果表明，PA處理24h后可以引起處于早期凋亡階段的細(xì)胞數(shù)量顯著增加。

圖1 DAPI染色鑒定L02細(xì)胞凋亡結(jié)果40×

AV／PI雙染法通過檢測細(xì)胞膜上的磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS），可以快速、靈敏地檢測出細(xì)胞混合物中凋亡細(xì)胞的含量。AV／PI雙染后進(jìn)行流式細(xì)胞檢測細(xì)胞凋亡率，每組重復(fù)3次后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。試驗(yàn)結(jié)果顯示，在L02細(xì)胞的培養(yǎng)體系中加入PA可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡率的上升，而且PA主要引起處于早期凋亡階段的細(xì)胞數(shù)量增加（圖6）?？傮w的細(xì)胞凋亡率從對照組的3．6±0．3%上升至18．7±0．9%。

統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，與對照組相比，30mg／mL的PA可顯著誘導(dǎo)L02細(xì)胞進(jìn)入凋亡早期階段（P＜0．05），PA 50mg／mL組L02細(xì)胞凋亡率為極顯著（P＜0．01）。上述結(jié)果說明，進(jìn)入早期凋亡階段L02細(xì)胞的數(shù)量與PA濃度正相關(guān)。

圖2 對照組流式細(xì)胞檢測結(jié)果

圖3 10mg／mL軟脂酸組流式細(xì)胞檢測結(jié)果

圖4 30mg／mL軟脂酸組流式細(xì)胞檢測結(jié)果

2．2 Caspase3與Caspase9Western blot檢測結(jié)果Caspase9前體及其激活物的檢測結(jié)果顯示（圖7圖8），PA并未影響 Caspase9前體（圖7）的水平，而Caspase9的激活物的水平（圖8）則隨PA劑量增加而升高，PA 為 30mg／mL 和50mg／mL 組 細(xì) 胞 內(nèi)Caspase9水平升高極顯著（P＜0．01）。即PA能夠激活Caspase9的前體，使其向激活物的方向轉(zhuǎn)變，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入凋亡程序。

圖5 50mg／mL軟脂酸組流式細(xì)胞檢測結(jié)果

圖6 PA對細(xì)胞凋亡率的影響

圖7 PA對L02細(xì)胞內(nèi)procaspase9的影響

對Caspase3與的Western blot檢測結(jié)果顯示（圖9圖10），與未添加PA的對照組相比，隨著PA濃度的上升，Caspase3激活物（20kd）的表達(dá)逐漸上調(diào)（圖10）此過程同時伴有Caspase3前體表達(dá)量的降低（圖9），當(dāng)PA劑量為30mg／mL時，Caspase3激活物水平上升顯著（P＜0．05），當(dāng)PA劑量為50mg／mL時Caspase3激活物水平上升極顯著（P＜0．01）此結(jié)果表明PA可激活Caspase3進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入凋亡階段。

圖8 PA對L02細(xì)胞內(nèi)Caspase9的影響

圖9 PA對L02細(xì)胞內(nèi)procaspase3的影響

圖10 PA對L02細(xì)胞內(nèi)Caspase3的影響

3 討論

本研究的形態(tài)學(xué)檢測顯示，各PA劑量組內(nèi)發(fā)生凋亡的細(xì)胞多處于凋亡早期，細(xì)胞發(fā)生腫脹，核呈現(xiàn)出波紋狀和濃染的亮點(diǎn)；處于凋亡晚期，細(xì)胞核形成凋亡小體的細(xì)胞數(shù)量較少。流式細(xì)胞檢測結(jié)果也與上述結(jié)果相吻合，且PA與處于凋亡早期的細(xì)胞數(shù)量之間呈現(xiàn)正相關(guān)的關(guān)系。進(jìn)一步通過 Western blot檢測Caspase3與Caspase9后，我們發(fā)現(xiàn)PA可以促進(jìn)激活的Caspase3和Caspase9從二者的前體上裂解下來，誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入凋亡的早期階段。在線粒體信號通路介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程中，隨著線粒體膜電位的下降，大量的細(xì)胞色素c從線粒體釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，與細(xì)胞質(zhì)中蛋白 Apaf－1結(jié)合，使得Caspase－9酶原活化，進(jìn)而激活下游的效應(yīng)半胱氨酸蛋白酶Caspase－3［8］，Caspase－3是半胱氨酸蛋白酶酶家族中導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的最強(qiáng)大的最終效應(yīng)因子，Caspase－3被激活后，作用于細(xì)胞質(zhì)成分，而使細(xì)胞發(fā)生凋亡［9］。類似的研究指出，肝癌細(xì)胞系HepG2在體外發(fā)生脂代謝障礙時可增強(qiáng)其TNF－α的分泌并進(jìn)一步誘發(fā)細(xì)胞凋亡［10－11］。TNF－α可通過多個下游信號誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，Caspase9和Casepase3也是其中之一，上述內(nèi)容與本研究的結(jié)果相一致。Seidel，N等也曾報道，臨床肝臟表現(xiàn)為輕微脂肪變性時以轉(zhuǎn)氨酶為代表的常規(guī)生化指標(biāo)并未表現(xiàn)異常，但血液及肝細(xì)胞內(nèi)Caspase3水平卻發(fā)生了顯著變化［12］。綜上所述，Caspase9與Casepase3信號可能在PA誘導(dǎo)L02細(xì)胞發(fā)生脂凋亡過程中起到重要作用。

［1］ Pagliassotti M J，Prach P A，Koppenhafer T A，etal．Changes in insulin action，triglycerides，and lipid composition during sucrose feeding in rats［J］．Am J Physiol，1996，271（5Pt 2）：R1319－R1326．

［2］ Tsuda T，Horio F，Uchida K，etal．Dietary cyanidin 3－O－beta－D－glucoside－rich purple corn color prevents obesity and ameliorates hyperglycemia in mice［J］．J Nutr，2003，133（7）：2125－2130．

［3］ Commerford S R，F(xiàn)erniza J B，Bizeau M E，etal．Diets enriched in sucrose or fat increase gluconeogenesis and G－6－Pase but not basal glucose production in rats［J］．Am J Physiol Endocrinol Metab，2002，283（3）：E545－E555．

［4］ Mccullough A J．The clinical features，diagnosis and natural history of nonalcoholic fatty liver disease［J］．Clin Liver Dis，2004，8（3）：521－533．

［5］ Unger R H．Lipid overload and overflow：metabolic trauma and the metabolic syndrome［J］．Trends Endocrinol Metab，2003，14（9）：398－403．

［6］ Lee Y，Hirose H，Ohneda M，etal．Beta－cell lipotoxicity in the pathogenesis of non－insulin－dependent diabetes mellitus of obese rats：impairment in adipocyte－beta－cell relationships［J］．Proc Natl Acad Sci U S A，1994，91（23）：10878－10882．

［7］ Browning J D，Horton J D．Molecular mediators of hepatic steatosis and liver injury［J］．J Clin Invest．2004，114（2）：147－152．

［8］ Antonsson B．Bax and other pro－apoptotic Bcl－2family“killer－proteins”and their victim the mitochondrion［J］．Cell Tissue Res，2001，306（3）：347－361．

［9］ Tang X L，Yang X Y，Jung H J，etal．Asiatic acid induces colon cancer cell growth inhibition and apoptosis through mitochondrial death cascade［J］．Biol Pharm Bull，2009，32（8）：1399－1405．

［10］陳少東，胡義揚(yáng)，馮琴，等．基于均勻設(shè)計(jì)的祛濕化瘀復(fù)方抗脂毒性作用的主效應(yīng)中藥分析［J］．中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2008（5）：421－425．

［11］管弦，黃菲，吳紀(jì)祖，等．六味地黃丸 銀杏葉片對早期2型糖尿病胰島素抵抗與脂毒性的影響［J］．遼寧中醫(yī)雜志，2006（11）：1423－1426．

［12］Seidel N，Volkmann X，Langer F，etal．The extent of liver steatosis in chronic hepatitis C virus infection is mirrored by caspase activity in serum［J］．Hepatology，2005，42（1）：113－120．