焦玉蘭，朱秀同，趙玉龍，任 欣，楊保收，梁 武

［瑞普（保定）生物有限公司，河北 保定071000］

目前，禽呼腸孤病毒（REOV）檢測(cè)方法主要采取PCR檢測(cè)及血清ELISA檢測(cè)法。采用PCR檢測(cè)抗原法，缺少敏感性、特異性試驗(yàn)數(shù)據(jù)；而血清檢測(cè)法，由于采集血清，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且易引起雞的應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致雞只生產(chǎn)性能下降，甚至誘發(fā)疾?。?］，且給獸醫(yī)生物制藥廠家的原材料檢測(cè)造成一定的困難。針對(duì)上述問(wèn)題，農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)局召開(kāi)了獸醫(yī)生物制品原材料檢測(cè)方法研討會(huì)，會(huì)議中，與會(huì)專家就SPF種蛋檢測(cè)方法進(jìn)行了評(píng)價(jià)［2］，提出了ELISA檢測(cè)REOV卵黃抗體的新的思路與方法。

卵黃抗體是指雞、鴨、鵝等蛋禽卵黃中存在的抗體，也稱卵黃免疫球蛋白［3］，利用禽呼腸孤病毒具有可垂直傳播的特性［4］，以及ELISA檢測(cè)方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、快捷［5］的優(yōu)勢(shì)，本試驗(yàn)通過(guò)進(jìn)行ELISA檢測(cè)卵黃和對(duì)應(yīng)血清中REOV抗體相關(guān)性試驗(yàn) ，以期確定卵黃抗體和血清抗體的對(duì)應(yīng)關(guān)系，并依此建立ELISA試劑盒檢測(cè)卵黃抗體的處理方法及判定標(biāo)準(zhǔn)。

1 材料

1．1 種蛋 150日齡SPF產(chǎn)蛋雞34只，由山東賽福實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司配合完成，血清經(jīng)ELISA檢測(cè)REOV抗體陰性，每15d采集血清和收集種蛋1次，做好標(biāo)記，血清和種蛋編號(hào)一一對(duì)應(yīng)，共收集3次。

130日齡普通初產(chǎn)產(chǎn)蛋雞30只，購(gòu)自河北保定清苑某養(yǎng)雞場(chǎng)，血清經(jīng)ELISA檢測(cè)REOV抗體陽(yáng)性，每15d采集血清和收集種蛋，做好標(biāo)記，血清和種蛋編號(hào)一一對(duì)應(yīng)。共收集4次。

1．2 試劑 氯仿（天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠）；生理鹽水（自配）；REOV－ELISA檢測(cè)試劑盒（IDEXX公司），批號(hào)：BG636；去離子水（自制）。

1．3 儀器設(shè)備 酶標(biāo)分析儀（DNM－9602型），100～1 000μL移液器及槍頭，100μL移液器及槍頭，0．5～300μL移液器及槍頭，2．5μL移液器及槍頭，0．5～10μL移液器及槍頭，封口膜，2mL離心管，1．5mL離心管，移液槽，低溫高速離心機(jī)（型號(hào)：Sigma），電熱恒溫水浴鍋（型號(hào)：DK－98－1型）。

2 試驗(yàn)方法

2．1 種蛋REOV卵黃抗體檢測(cè)操作方法

2．1．1 樣品處理 采用氯仿抽提卵黃抗體方法，300 μL卵黃＋600μL生理鹽水＋900μL氯仿，充分振蕩后，37℃水浴30min，期間攪拌2～3次，然后4 000r／min離心20min，取上層水相，即為卵黃抗體。

2．1．2 試劑盒操作程序 （一）樣品準(zhǔn)備：在檢測(cè)前，用樣品稀釋液將卵黃抗體作1∶100倍稀釋（5μL的樣品用樣品稀釋液稀釋到500μL）。每個(gè)樣品都要換一個(gè)吸頭。樣品加入抗原包被孔之前要充分混合均勻。（二）操作步驟：試劑盒各組分放置至室溫（18℃～25℃），顛倒搖動(dòng)混合均勻。（1）取出包被板，在表上記錄樣品位置。（2）加100μL不需稀釋的陰性對(duì)照血清至A1孔和B1孔。（3）加100μL不需稀釋的陰性對(duì)照血清至C1孔和D1孔。（4）加100μL稀釋好的樣品至相應(yīng)的孔內(nèi)。樣品采用雙孔檢測(cè)。（5）在室溫（18℃～25℃）孵育30min。（6）吸出所有孔內(nèi)的液體排到適當(dāng)?shù)膹U液缸。（7）用大約300 μL蒸餾水或去離子水洗滌微孔共3～5次，并將孔內(nèi)液體完全吸干。（8）每孔加入100μL酶標(biāo)羊抗雞抗體（HRPO）。（9）在室溫（18℃～25℃）孵育30 min。（10）重復(fù)步驟（6）和（7）。（11）每孔加入100 μL TMB底物溶液。（12）在室溫（18℃～25℃）孵育15min。（13）每孔加入100μL終止液終止反應(yīng)。（14）空氣調(diào)零，在650nm，A（650）測(cè)量和記錄吸光值。

2．1．3 判定標(biāo)準(zhǔn) 只有在陽(yáng)性對(duì)照孔所得的均值減去陰性對(duì)照孔所得值的均值（PCX－NCX）必須大于0．075時(shí)，陰性對(duì)照孔所得值的均值必須小于或等于0．150時(shí)，測(cè)定結(jié)果才有效。樣品的S／P值小于或等于0．2，判為陰性。樣品的S／P值大于或等于0．2，判為陽(yáng)性，表示免疫過(guò)或感染過(guò)REO。

計(jì)算：

（1）陰性對(duì)照平均值（NCX）＝A1孔 A（650）＋B1孔A（650）／2；（2）陽(yáng)性對(duì)照平均值（PCX）＝C1孔 A（650）＋D1孔 A（650）／2；（3）S／P 值＝樣品（650）－NCX／PCX－NCX。

2．2 REOV抗體陰性SPF雞對(duì)應(yīng)種蛋卵黃直接稀釋與氯仿處理樣品不同稀釋倍數(shù)ELISA檢測(cè)對(duì)比

選取經(jīng)ELISA檢測(cè)血清REOV抗體陰性的SPF雞收集的種蛋，采用直接稀釋卵黃和氯仿處理卵黃兩種方法，對(duì)比分析二者與血清檢測(cè)結(jié)果的一致性。直接稀釋法采用將卵黃直接進(jìn)行1∶100、1∶200、1∶400稀釋；氯仿抽提卵黃抗體方法［6］為：300μL卵黃＋600μL生理鹽水＋900μL氯仿，充分振蕩后，37℃水浴30min，期間攪拌2～3次，然后4 000r／min離心20min，取上層水相進(jìn)行1∶100、1∶200、1∶400稀釋作為檢品，分別按照ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)比分析卵黃樣品S／P值與血清S／P值的差異。

2．3 REOV抗體陽(yáng)性雞對(duì)應(yīng)種蛋氯仿處理卵黃不同稀釋倍數(shù)ELISA檢測(cè)對(duì)比 選取經(jīng)ELISA檢測(cè)血清REOV抗體陽(yáng)性種雞的種蛋，采用氯仿抽提卵黃抗體方法［6］，300μL卵黃＋600μL生理鹽水＋900μL氯仿，充分振蕩后，37℃水浴30min，期間攪拌2～3次，然后4 000r／min離心20min，取上層水相進(jìn)行1∶100、1∶200、1∶400稀釋作為檢品，分別按照ELISA檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)比分析不同稀釋倍數(shù)的卵黃樣品S／P值與血清S／P值的差異。

2．4 大樣本SPF雞和普通雞血清和種蛋處理卵黃ELISA檢測(cè)對(duì)比 根據(jù)2．2、2．3確定的稀釋倍數(shù)對(duì)SPF雞和普通雞采集的血清和種蛋卵黃進(jìn)行大批量樣本檢測(cè)，對(duì)比分析血清與卵黃檢測(cè)S／P值及REOV抗體判定的符合率。

符合率計(jì)算公式：符合率＝（與血清檢測(cè)結(jié)果一致的雞蛋份數(shù)／種蛋檢測(cè)總數(shù)）×100%

3 結(jié)果及分析

3．1 REOV抗體陰性SPF雞種蛋卵黃直接稀釋與氯仿處理樣品不同稀釋倍數(shù)ELISA檢測(cè)結(jié)果 選取5份血清REOV抗體陰性的SPF種雞及對(duì)應(yīng)種蛋，分別采用水稀釋法和氯仿抽提法提取卵黃抗體，并做1∶100、1∶200、1∶400的倍比稀釋進(jìn)行ELISA檢測(cè)，血清根據(jù)試劑盒要求做1∶500稀釋。檢測(cè)結(jié)果表明，卵黃直接稀釋法不同稀釋倍數(shù)和不同樣品之間檢測(cè)值差異較大。卵黃經(jīng)氯仿抽提后不同稀釋倍數(shù)和不同樣品的S／P值較穩(wěn)定，且氯仿抽提卵黃抗體檢測(cè)法1∶100的稀釋度檢測(cè)結(jié)果與血清值最為接近。

3．2 REOV抗體陽(yáng)性種雞對(duì)應(yīng)種蛋氯仿處理卵黃不同稀釋倍數(shù)ELISA檢測(cè)結(jié)果 選取21個(gè)陽(yáng)性血清樣本及對(duì)應(yīng)卵黃，卵黃經(jīng)氯仿處理后做1∶100、1∶200、1∶400稀釋，再次進(jìn)行稀釋度試驗(yàn)，檢測(cè)結(jié)果表明，選取的21個(gè)陽(yáng)性種蛋卵黃經(jīng)氯仿處理后不同稀釋度及不同樣品的S／P值均較穩(wěn)定，其中1∶100的稀釋度最接近血清值。

綜合3．1和3．2結(jié)果，確定采用氯仿抽提卵黃抗體方法，抽提后進(jìn)行1∶100稀釋。

3．3 大樣本SPF雞和普通雞血清和種蛋處理卵黃ELISA檢測(cè)結(jié)果 通過(guò)檢測(cè)定期收集的SPF雞血清、種蛋及普通雞血清、種蛋，用上述確定的方法進(jìn)行大批量樣本檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)二者差異性，得出二者符合率。

3．3．1 SPF雞樣本檢測(cè)結(jié)果及分析 將隨機(jī)抽取的103份SPF雞樣本的檢測(cè)數(shù)據(jù)，用SPSS 13．0軟件進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，血清和卵黃抗體檢測(cè)結(jié)果差異不顯著（P≥0．05）。

3．3．2 普通雞樣本檢測(cè)結(jié)果及分析 將隨機(jī)抽取103個(gè)普通雞樣本的檢測(cè)數(shù)據(jù)，用SPSS 13．0軟件進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，血清和卵黃抗體檢測(cè)結(jié)果差異不顯著（P≥0．05）。

3．3．3 SPF雞樣本及普通雞樣本檢測(cè)結(jié)果綜合分析 見(jiàn)表1。

表1 符合率分析

如表1所示，綜合SPF雞樣本及普通雞樣本檢測(cè)結(jié)果，相對(duì)于血清ELISA檢測(cè)法，卵黃ELISA檢測(cè)法的符合率：陰性符合率為52．91%（109／206）；陽(yáng)性符合率52．91%（91／206）；總符合率為97．08%［（91＋109）／206］。

4 討論

REOV是主要經(jīng)蛋傳播疾病之一，世界各地均有發(fā)生。有資料證明，養(yǎng)殖場(chǎng)蛋雞發(fā)病率高達(dá)90%以上，可引發(fā)雞多種疾病，包括病毒性關(guān)節(jié)炎／腱鞘炎、矮小綜合征、呼吸道疾病、腸道疾病和所謂吸收不良綜合征。經(jīng)濟(jì)損失常由病毒性關(guān)節(jié)炎／腱鞘炎和受害雞增重減少、飼料轉(zhuǎn)換下降等生產(chǎn)性能差引起［7］，給養(yǎng)禽業(yè)造成了極大的威脅。若生產(chǎn)疫苗所用種蛋中含有此病毒，很有可能會(huì)造成所產(chǎn)疫苗中含有REOV，免疫雞只后，極易導(dǎo)致雞只發(fā)病，給養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)極大的經(jīng)濟(jì)損失。

對(duì)于REO疾病的診斷及抗體水平的檢測(cè)，血清ELISA檢測(cè)法，由于采血取樣過(guò)程費(fèi)時(shí)費(fèi)力，并且，每次采血取樣，都會(huì)對(duì)雞只產(chǎn)生不同程度的應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致生產(chǎn)性能下降，甚至誘發(fā)疾病。同時(shí)，根據(jù)REOV具有可垂直傳播的特性，若能夠掌握血清抗體和卵黃抗體之間的相關(guān)性，通過(guò)檢測(cè)卵黃抗體水平，能夠掌握血清抗體水平，將會(huì)具有重要的臨床實(shí)踐意義。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，采用REOV－ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)雞血清及對(duì)應(yīng)卵黃中的REOV抗體水平，二者具有良好的相關(guān)性；相對(duì)于血清ELISA檢測(cè)法，所選雞樣品卵黃ELISA檢測(cè)法的符合率97．08%，表明可以采用檢測(cè)血清的REOV－ELISA試劑盒檢測(cè)卵黃中的REOV抗體水平。采用卵黃做樣品，可以避免采血對(duì)雞產(chǎn)生的應(yīng)激及其連帶的經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)節(jié)省了采血所需時(shí)間。

［1］ 楊百亮，郭羽．瓊擴(kuò)試驗(yàn)檢測(cè)雞傳染性法氏囊病卵黃抗體的研究［J］．天津農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，2004，11（4）：27－29．

［2］ 農(nóng)業(yè)部關(guān)于SPF蛋檢測(cè)方法進(jìn)行評(píng)價(jià)的復(fù)函［Z］．部評(píng)審（生）［2011］70號(hào)．

［3］ 陳斌，楊志華．雞卵黃免疫球蛋白（IgY）的作用機(jī)理及應(yīng)用前景［J］．浙江畜牧獸醫(yī)，2005（1）：9－10．

［4］ 蔡寶祥．家畜傳染病學(xué)［M］．北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2001：324－325．

［5］ 范祚舟，徐加發(fā)，等．酶聯(lián)免疫分析技術(shù)研究發(fā)展［J］．分析科學(xué)學(xué)報(bào)，2011，27（1）：113－117．

［6］ 鄭立勇，喬彥良，馬鳳龍，等．卵黃抗體不同提取方法的比較［J］．黑龍江畜牧獸醫(yī)，2009（1）：106－107．

［7］ 李巨銀，胡新崗，魏寧．禽呼腸孤病毒病的研究進(jìn)展［J］．甘肅畜牧獸醫(yī)，2011（4）：30－31．