許 芹 永, 宋 青 楠, 朱 靖 博, 蕭 偉

( 1.大連工業(yè)大學(xué) 植物資源化學(xué)與應(yīng)用研究所, 遼寧 大連 116034; 2.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司, 江蘇 連云港 222001 )

0 引 言

α-葡萄糖苷酶抑制劑可競爭性抑制小腸內(nèi)α-葡萄糖苷酶的活性,延緩或抑制葡萄糖在腸道的吸收。由于其獨(dú)特的作用特點(diǎn),已第3次被亞太地區(qū)糖尿病治療藥物指南推薦為降餐后血糖水平的一線藥物[1]。人工合成的α-葡萄糖苷酶抑制劑除價(jià)格昂貴之外,在臨床上也會(huì)伴隨強(qiáng)烈的副作用,因此天然α-葡萄糖苷酶抑制劑的發(fā)現(xiàn),特別是從藥食兩用中藥中尋找新的α-葡萄糖苷酶抑制劑成分,成為醫(yī)學(xué)界和食品界研究的熱點(diǎn)。

藥食兩用中藥肉桂為樟科植物肉桂CinnamomumcassiaPresl的干燥樹皮,其性味辛、甘、大熱,具有補(bǔ)火助陽、引火歸源、散寒止痛、活血通經(jīng)的功能。目前對(duì)于肉桂降血糖的研究已有相關(guān)報(bào)道[2-3],但都只是針對(duì)某一極性部位的研究。本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)地對(duì)肉桂提取物的α-葡萄糖苷酶抑制活性進(jìn)行評(píng)價(jià),并對(duì)活性最高的正丁醇部位進(jìn)行酶抑制動(dòng)力學(xué)研究,為尋找新的α-葡萄糖苷酶抑制劑提供理論依據(jù)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料與儀器

肉桂購自河北安國中藥材市場；α-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.20,面包酵母,純度≥10 U/mg),Sigma公司；對(duì)-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷,PNPG,純度99%,Sigma公司；對(duì)-硝基酚,PNP,分析純；牛血清白蛋白,BSA,純度≥95%,Sigma公司；阿卡波糖片,Acarbose,50 mg/片,拜耳醫(yī)藥保健有限公司。

UltiMate 3000高效液相色譜分析儀；微型植物粉碎機(jī)；SK250H超聲波清洗器；PNS-3C型pH酸度計(jì)；SK-1型快速混勻器； DZF-6050真空冷凍干燥機(jī)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 肉桂提取物的制備

將干燥肉桂皮粉碎,用95%甲醇加熱回流提取3次,過濾后合并3次濾液并減壓回收甲醇至小體積,將濃縮的提取物分散在水中,依次用等體積石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和飽和正丁醇萃取3次,回收溶劑至干,分別得石油醚部位(PE)、二氯甲烷部位(MC)、乙酸乙酯部位(EA)、正丁醇部位(BU)和水部位(AQ)提取物。

1.2.2 α-葡萄糖苷酶抑制活性的篩選方法

1.2.2.1 α-葡萄糖苷酶抑制活性的測定

本實(shí)驗(yàn)所采用的反應(yīng)體系是參照朱文佳[4]的方法,并在其基礎(chǔ)上稍加改進(jìn),具體如下:將0.067 mol/L pH 6.8的磷酸鹽緩沖溶液25 μL、待測樣品5 μL、0.1 U/mL α-葡萄糖苷酶30 μL,振蕩混勻,37 ℃恒溫孵育20 min,加入4.0 mmol/L PNPG 20 μL,振蕩混勻,37 ℃恒溫反應(yīng)30 min后,加入0.2 mol/L Na2CO380 μL終止反應(yīng)。超純水稀釋至500 μL,振蕩混勻,經(jīng)0.45 μm膜過濾后,用HPLC檢測,求得α-葡萄糖苷酶的抑制活性。

1.2.2.2 檢測方法

本實(shí)驗(yàn)利用高效液相色譜法(HPLC)對(duì)酶解生成PNP進(jìn)行檢測,按照下式計(jì)算抑制率,并用Origin軟件求出相應(yīng)的IC50值。

式中:cA為不加肉桂提取物時(shí)PNP的濃度(扣除相應(yīng)空白),mmol/L；cB為加入肉桂提取物后PNP的濃度(扣除相應(yīng)空白),mmol/L。同時(shí)設(shè)有空白對(duì)照組和陽性對(duì)照組(Acarbose)。

色譜條件:Sino Chrom ODS-BP色譜柱(5 μm,4.6 mm×250 mm,大連依利特分析儀器有限公司)；流動(dòng)相:A為乙腈,B為含0.1%甲酸的水溶液。梯度洗脫條件為:0～8 min,20%～30% A；8～13 min,30%～80% A；13～18 min,80%～20% A；18～28 min,20% A。體積流量,1.0 mL/min；進(jìn)樣量,20 μL；柱溫,常溫；檢測波長,315 nm。

1.2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)采用的反應(yīng)體系,精確稱取0.109 8 g PNP標(biāo)準(zhǔn)品,用PBS(磷酸鹽緩沖溶液,0.067 mmol/L,pH=6.8)超聲溶解,定容于25 mL 容量瓶中,配制成31.25 mmol/L的PNP母液,將其稀釋成1 250、625、312.500、62.500、31.250、15.625 μmol/L。分別各取80 μL,加入80 μL 0.2 mol/L Na2CO3溶液,用超純水稀釋至500 μL,混勻,過0.45 μm濾膜用液相色譜分析。以PNP峰面積為縱坐標(biāo), PNP濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2.4 抑制作用類型的確定

在抑制劑量一定的條件下,加入不同濃度(0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mmol/L)的底物PNPG,測定酶活力。而后改變抑制劑的量,得出一系列不同底物濃度下的酶活力,按Lineweave-Burk作圖法,繪制1/[S]～1/V雙倒數(shù)曲線,確定其動(dòng)力學(xué)特征及其Km、Ki值。

2 結(jié)果與討論

2.1 PNP標(biāo)準(zhǔn)曲線

按照“1.2.2.2”的方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,求得回歸方程為y=1 971x-5.134 8,R2=0.999 9,說明PNP在0～1.25 mmol/L線性關(guān)系良好。

2.2 不同提取部位的α-葡萄糖苷酶抑制活性

肉桂不同部位提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性見表1。表1顯示,同一濃度下,肉桂各部位提取物均有一定的α-葡萄糖苷酶抑制活性,且活性都高于對(duì)照組Acarbose。當(dāng)樣品濃度為625 μg/mL 時(shí),乙酸乙酯部位和正丁醇部位的抑制率均能達(dá)到100%。通過對(duì)各部位的半數(shù)抑制濃度IC50的測定,可得正丁醇部位的IC50(IC50=83.10 μg/mL)小于乙酸乙酯部位的IC50(IC50=123.59 μg/mL),所以正丁醇部位的抑制活性高于乙酸乙酯部位。另外各部位的IC50都小于Acarbose的IC50,尤其是肉桂正丁醇提取物最低,顯示非常強(qiáng)的α-葡萄糖苷酶抑制活性,因此對(duì)該部位進(jìn)行了酶的抑制動(dòng)力學(xué)研究。

表1 不同提取物的α-葡萄糖苷酶抑制活性

Tab.1 α-Glucosidase inhibitory activity of extracts ofCinnamomicassia

樣品ρ/(μg·mL-1)抑制率/%IC50/(μg·mL-1)Acarbose62548.021 028.99PE62582.77350.37MC62569.33408.77EA625100.00123.59BU625100.0083.10AQ62585.95235.26

2.3 提取物質(zhì)量濃度對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性影響

由圖1可見,在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi),肉桂5個(gè)部位提取物的α-葡萄糖苷酶抑制活性與其濃度均呈劑量依賴關(guān)系,即隨著提取物質(zhì)量濃度的升高,抑制率增大,而且當(dāng)抑制率增大到一定水平時(shí),不再隨著提取物質(zhì)量濃度的升高而明顯提高。

圖1 提取物質(zhì)量濃度對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響

Fig.1 Effect of concentration of extracts on inhibitory activity of α-glucosidase

由圖1可見,正丁醇部位在五者中抑制率最高,抑制率隨質(zhì)量濃度升高迅速升高,最大抑制率達(dá)到100%。乙酸乙酯部位和正丁醇部位提取物的活性相差不大,兩種提取物分別在250.00和375.00 μg/mL時(shí)能達(dá)到最高抑制率100%。而肉桂石油醚部位、二氯甲烷部位及水部位在質(zhì)量濃度為500.00 μg/mL時(shí),抑制率隨著質(zhì)量濃度的增加而增大,但當(dāng)增大到625.00 μg/mL時(shí),抑制率分別達(dá)到82.77%、69.33%和85.95%。再增加提取物質(zhì)量濃度,抑制率增加緩慢,達(dá)到一個(gè)“平臺(tái)期”。由此可見,這3個(gè)部位提取物的抑制率不能達(dá)到100%,這可能是由于它們含有的有效成分不同,從而導(dǎo)致作用機(jī)制不同。

2.4 肉桂正丁醇部位的抑制動(dòng)力學(xué)研究

肉桂的正丁醇部位分別取合適的2個(gè)不同質(zhì)量濃度,PNPG取合適的5個(gè)不同摩爾濃度,分別測定反應(yīng)速度。按Lineweaver-Burk作圖法,以1/V為縱坐標(biāo),1/[S]為橫坐標(biāo),繪制出酶抑制作用動(dòng)力學(xué)曲線,得到α-葡萄糖苷酶的米氏常數(shù)Km為1.37 mmol/L,最大反應(yīng)速度Vmax為0.039 mmol/L。

圖2 正丁醇提取物L(fēng)ineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線

由圖2可以看出,隨著抑制劑濃度的增大,酶的最大反應(yīng)速度Vmax和米氏常數(shù)Km均減小,判斷其對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性作用屬反競爭性抑制作用[5]。根據(jù)反競爭性抑制動(dòng)力學(xué)方程:

3 結(jié) 論

肉桂各部位提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶均具有一定的抑制活性,且與質(zhì)量濃度呈正相關(guān)性。其中,正丁醇部位的活性最高,張忠[6]的研究曾指出,肉桂的乙醇索氏提取物中的α-葡萄糖苷酶抑制活性成分為鞣質(zhì)類。抑制動(dòng)力學(xué)研究表明,其抑制類型為反競爭性抑制,為肉桂開發(fā)為降糖藥物提供了理論參考數(shù)據(jù)。

[1] LEVETTAN C. Oral antidiabetic agents in type 2 diabetes[J]. Current Medical Research and Opinion, 2007, 23(4):945-952.

[2] 胥新元,彭艷梅,彭源貴,等. 肉桂揮發(fā)油降血糖的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 中國中醫(yī)藥信息雜志, 2001, 8(2):26.

[3] KIM S H, HYUN S H, CHOUNG S Y. Anti-diabetic effect ofCinnamonextract on blood glucose in db/db mice[J]. Journal of Ethnopharmacology, 2006, 104(1/2):119-123.

[4] 朱文佳. 中藥中抑制α-葡萄糖苷酶活性組分的研究[D]. 大連:大連工業(yè)大學(xué), 2010:4.

[5] 陳靜坤,姚江武. 紅茶和綠茶與人唾液α-淀粉酶相互作用的酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究[J]. 口腔醫(yī)學(xué), 2010, 26(4):471-474.

[6] 張忠. 中藥肉桂提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用研究[D]. 上海:上海大學(xué), 2006:66.