蘇利紅，曹雨莉，李 飛，孫小琴，劉瑞芳

（西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西楊凌712100）

反芻動(dòng)物瘤胃就像一個(gè)密閉發(fā)酵罐，在動(dòng)物消化系統(tǒng)中有著重要作用，其對(duì)飼料養(yǎng)分的消化吸收依賴于其中微生物動(dòng)力學(xué)過(guò)程中產(chǎn)生的大量的揮發(fā)性脂肪酸（volatile fatty acid，VFA）。VFA是碳鏈為1～6的脂肪酸，對(duì)動(dòng)物體代謝作用最為重要的是乙酸、丙酸和丁酸，約占瘤胃發(fā)酵VFA總量的95%。VFA是反芻動(dòng)物能量利用中一個(gè)重要的中間代謝產(chǎn)物，其含量及組成比例是反映瘤胃微生物發(fā)酵類型和消化代謝活動(dòng)的重要指標(biāo)。據(jù)報(bào)道瘤胃液VFA約可提供反芻動(dòng)物所需能量的70%［1］。而乙酸、丙酸和丁酸所提供的能量效率不同，所以VFA的比例影響著其供能的總量［2］。瘤胃VFA可使瘤胃維持在一個(gè)較理想的酸性環(huán)境，適合微生物的繁殖和寄生，這些微生物又進(jìn)一步通過(guò)發(fā)酵瘤胃飼料，使瘤胃處于一個(gè)良性循環(huán)的酸性環(huán)境中［3］。VFA還能增加動(dòng)物血漿中胃動(dòng)素和胃泌素的水平，從而促進(jìn)胃的排空，增加胃及上部腸道黏膜細(xì)胞的分裂增殖，刺激胃蛋白酶、胰島素、降鈣素的分泌和膽囊收縮。此外，VFA還能有效提高動(dòng)物腸道抵御病原微生物的能力，其中乙酸和丙酸能抑制志賀菌的生長(zhǎng)，高濃度的VFA可以抑制沙門菌和大腸埃希菌的生長(zhǎng)。VFA還能幫助動(dòng)物機(jī)體維持腸道黏膜的屏障作用，可以有效預(yù)防潰瘍性結(jié)腸炎和其他炎癥。所以，精確測(cè)定瘤胃中VFA的含量極其組成比例，不僅為研究瘤胃消化代謝提供重要參數(shù)，而且有利于動(dòng)物疾病的診治［4］。

VFA傳統(tǒng)的測(cè)定方法有比色法、滴定法、熒光法及色譜法等，比色法只能測(cè)定單一的酸，不能測(cè)混合酸；滴定法分析速度較慢，步驟繁瑣，容易產(chǎn)生誤差，同時(shí)，不能將不同種類的揮發(fā)性脂肪酸有效分離；熒光法測(cè)定VFA的原理是將VFA轉(zhuǎn)化為具有熒光特性的物質(zhì)，然后通過(guò)熒光分光光度計(jì)測(cè)定VFA的含量，此方法因?yàn)樾枰猇FA可以轉(zhuǎn)化成帶有強(qiáng)烈熒光特性的物質(zhì)，因此不能廣泛應(yīng)用；氣相色譜法測(cè)定VFA樣品前處理的方法較繁瑣，特別是酯化、萃取酯化等中間步驟需要耗費(fèi)相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間。總之，建立一種快速、簡(jiǎn)單、有效的測(cè)量VFA的方法是非常有意義的。反相高效液相色譜測(cè)量脂肪酸具有快速、預(yù)處理簡(jiǎn)單、分析結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，而利用高效液相色譜測(cè)定VFA的報(bào)道較少［5－7］。高效液相色譜中流動(dòng)相通常是各種低沸點(diǎn)溶劑和水溶液，它對(duì)組分有親和力，并參與固定相對(duì)組分的競(jìng)爭(zhēng)。同時(shí)，流動(dòng)相pH是影響分離效果的一個(gè)關(guān)鍵因素。

因此，本試驗(yàn)主要從流動(dòng)相、pH等方面研究高效液相色譜測(cè)定VFA的條件選擇和優(yōu)化。為廣泛利用高效液相色譜測(cè)定VFA提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器 高效液相色譜分析儀（日立，Hi－tachi L－2000型）；進(jìn)樣器（安捷倫，Agilent 7693A）；精密pH計(jì)（賽多利斯，PHS－3C型）。

1.1.2 主要試劑 磷酸、磷酸二氫鉀、乙酸、丙酸、丁酸標(biāo)準(zhǔn)品均為分析純（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；甲醇、乙腈為高效液相色譜純（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；試驗(yàn)用水為超純水綜合系統(tǒng)（PL5124）制得的超純水。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理 安裝瘤胃瘺管的山羊作為瘤胃液供體，用采樣管于晨飼前在瘤胃腹囊中進(jìn)行樣品采集，將采集的樣品用4層脫脂紗布過(guò)濾，取4mL濾液并加入250mL／L偏磷酸溶液1mL，置－20℃保存。樣品解凍后于4℃以19 000r／min離心15min，取上清液過(guò)0.22μm濾膜，進(jìn)樣。

1.2.2 色譜條件 色譜柱為 Agilent TC－C18柱（250mm×4.6mm i.d.5μm）；流速為0.6mL／min；進(jìn)樣體積20μL；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)210nm；柱溫為室溫。流動(dòng)相經(jīng)0.22μm纖維素膜過(guò)濾，超聲波脫氣。1.2.3 試驗(yàn)分組 本試驗(yàn)流動(dòng)相設(shè)置兩個(gè)水平，甲醇和乙腈，pH也設(shè)置兩個(gè)水平，2.05和2.30，根據(jù)流動(dòng)相組成和pH，將流動(dòng)相分為A、B、C、D 4種水平組合（表1）。

表1 不同流動(dòng)相組成Table 1 Composition of different mobile phases

1.2.4 回收率和精密度的計(jì)算 用瘤胃液空白樣測(cè)定本底值，在瘤胃液空白樣中分別加入200mmol／L的標(biāo)樣，檢測(cè)4種測(cè)定條件的回收率，回收率的計(jì)算利用以下的公式：

加標(biāo)回收率＝ （加標(biāo)試樣測(cè)定值－試樣測(cè)定值）÷加標(biāo)量×100%。

日內(nèi)精密度：測(cè)定同1天內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)4種檢測(cè)條件下3種VFA的濃度，每個(gè)測(cè)定項(xiàng)目重復(fù)6次，計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

日間精密度：連續(xù)3d測(cè)定4種檢測(cè)條件下3種VFA的濃度，每個(gè)測(cè)定項(xiàng)目重復(fù)6次，計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 同一樣品不同流動(dòng)相組間比較由t檢驗(yàn)完成，結(jié)果用ˉx±SD表示，顯著水平為P＜0.05。統(tǒng)計(jì)分析由SPSS 17.0完成。

2 結(jié)果

2.1 乙酸、丙酸、丁酸標(biāo)準(zhǔn)曲線及計(jì)算結(jié)果

精確配制一定濃度乙酸、丙酸和丁酸（33.838、26.498、39.700mmol／L）的混合標(biāo)樣，上樣前經(jīng)過(guò)0.22μm的合成纖維素酯膜過(guò)濾。以摩爾濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立回歸方程如表2所示。

表2 高效液相色譜測(cè)定乙酸、丙酸和丁酸含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 2 Standard curves of content measuring of acetic acid，propionic acid and butanoic acid by high performance liquid chromatography

2.2 乙酸、丙酸、丁酸標(biāo)準(zhǔn)液圖譜的采集

利用流動(dòng)相A、B、C、D對(duì)乙酸、丙酸、丁酸標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行分離采集圖1～圖4所示的圖譜。根據(jù)峰形和保留時(shí)間采集圖譜，4個(gè)不同流動(dòng)相測(cè)定乙酸、丙酸和丁酸標(biāo)準(zhǔn)液的圖譜如圖1～4所示，圖1和圖2中，乙酸的出峰時(shí)間分別為4.11和4.10，丙酸的出峰時(shí)間均為6.64，丁酸的出峰時(shí)間均為14.00；圖3和圖4中，乙酸的出峰時(shí)間為3.71，丙酸的出峰時(shí)間分別為5.08和5.11，丁酸的出峰時(shí)間為8.93和9.01。從這些數(shù)據(jù)可看出，同種流動(dòng)相在不同pH條件下標(biāo)準(zhǔn)液（乙酸、丙酸和丁酸）的出峰時(shí)間基本一致。

2.3 回收率和精密度的測(cè)定

本研究通過(guò)測(cè)定精密度和回收率對(duì)4種檢測(cè)體系的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。檢測(cè)結(jié)果如表3和表4所示。結(jié)果顯示，4種檢測(cè)體系測(cè)定VFA的回收率均在90%以上，檢測(cè)的日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差＜2%，日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差＜10%。這表明4種檢測(cè)條件檢測(cè)的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性均能達(dá)到VFA檢測(cè)的要求。

2.4 瘤胃液樣品測(cè)定

利用甲醇和乙腈作流動(dòng)相測(cè)定瘤胃液中的乙酸、丙酸、丁酸，根據(jù)采集的圖譜，得知樣品中3種酸對(duì)應(yīng)的峰面積和濃度如表5和表6所示。

圖1 乙酸、丙酸和丁酸標(biāo)準(zhǔn)樣圖譜 （流動(dòng)相A）Fig.1 Standard chromatograms of acetate，propionate and butyrate（Mobile phase A）

圖2 乙酸、丙酸和丁酸標(biāo)準(zhǔn)樣圖譜（流動(dòng)相B）Fig.2 Standard chromatograms of acetate，propionate and butyrate（Mobile phase B）

圖3 乙酸、丙酸和丁酸標(biāo)準(zhǔn)樣圖譜（流動(dòng)相C）Fig.3 Standard chromatograms of acetate，propionate and butyrate（Mobile phase C）

圖4 乙酸、丙酸和丁酸標(biāo)準(zhǔn)樣圖譜（流動(dòng)相D）Fig.4 Standard chromatograms of acetate，propionate and butyrate（Mobile phase D）

表3 不同測(cè)定條件下乙酸、丙酸和丁酸檢測(cè)的回收率Table 3 Recovery of acetic acid，propionic acid and butanoic acid under different test conditions

表4 不同測(cè)定條件下乙酸、丙酸和丁酸檢測(cè)的精密度（n＝6）Table 4 Precision of acetic acid，propionic acid and butanoic acid under different test conditions

表5 瘤胃液樣品乙酸、丙酸和丁酸峰面積和濃度Table 5 Peak area and concentration of acetate，propionate and butyrate in rumen fluid sample

表6 不同流動(dòng)相測(cè)定乙、丙、丁酸濃度的比較Table 6 Concentration comparison of acetate，propionate and butyrate with different mobile phases

同一瘤胃液樣品在4個(gè)流動(dòng)相下分別采集圖譜，并根據(jù)圖譜的峰面積計(jì)算乙酸、丙酸和丁酸的濃度，如表5所示。樣品1和樣品2是甲醇作流動(dòng)相時(shí)測(cè)定的結(jié)果，而樣品3和樣品4是乙腈作流動(dòng)相時(shí)測(cè)定的結(jié)果。從表5、表6中看出，同種流動(dòng)相測(cè)定樣品時(shí)，乙酸、丙酸和丁酸的濃度值相近，分別用甲醇和乙腈作流動(dòng)相測(cè)定時(shí)，乙酸、丙酸和丁酸的濃度有差異，經(jīng)顯著性檢驗(yàn)差異不顯著（P＞0.05）。

3 討論

在高效液相色譜分析中，甲醇和乙腈是兩種常用的流動(dòng)相溶劑。甲醇具有價(jià)格低廉的優(yōu)點(diǎn)，但也存在活性高，容易與樣品反應(yīng)的不足。而且甲醇在低波長(zhǎng)下會(huì)吸收一定量的紫外線，這些均會(huì)降低分析方法的靈敏度。相比較而言，乙腈具有洗脫能力強(qiáng)，不易與待測(cè)物反應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)，但也存在毒性強(qiáng)，價(jià)格高的缺點(diǎn)［9］。為了優(yōu)化高效液相色譜準(zhǔn)確檢測(cè)瘤胃液中3種VFA含量的條件，本研究首先對(duì)甲醇和乙腈兩種有機(jī)溶劑作為流動(dòng)相對(duì)乙酸、丙酸和丁酸的分離效果進(jìn)行了比較。結(jié)果表明甲醇和乙腈均能對(duì)3種VFA有效分離，其差異只是體現(xiàn)在出峰時(shí)間的不同。這與孫緒順［10］利用甲醇作流動(dòng)相的研究結(jié)果相一致。

流動(dòng)相的pH是影響待分析物分離效果的另一個(gè)重要因素。趙景嬋等認(rèn)為流動(dòng)相pH直接決定了VFA以何種形態(tài)存在，在檢測(cè)中只有使流動(dòng)相pH控制在一定范圍內(nèi)，才能抑制溶質(zhì)的離子化，減少譜帶拖尾、改善峰形，提高分離的選擇性［8］。為了摸索最佳pH，宋永康等［11］曾分析了pH 為2.2、2.4、2.5、2.6、2.8、3.0幾種流動(dòng)相對(duì)3種酸的分離效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以pH＝2.4的流動(dòng)相分離效果最好。在本研究中，根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前面研究的經(jīng)驗(yàn)，設(shè)置了2.05和2.30兩個(gè)流動(dòng)相pH，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在兩種pH條件下甲醇和乙腈分離效果相接近，這與白冬梅等［12］的發(fā)現(xiàn)是一致的，她們也發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相pH為2.2和2.5的流動(dòng)相對(duì)混合酸的分離效果相近。

在液相和氣相色譜分析中，精密度和回收率是常用的評(píng)價(jià)檢測(cè)體系穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性的兩個(gè)指標(biāo)。精密度系指在規(guī)定的測(cè)定條件下，用同一個(gè)樣品，經(jīng)多次測(cè)定所得各個(gè)結(jié)果之間的接近程度。由此可見精密度越低檢測(cè)方法越穩(wěn)定。而回收率是加標(biāo)實(shí)測(cè)的結(jié)果減去未加標(biāo)所測(cè)的結(jié)果，其差值同加入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的之比即為樣品加標(biāo)回收率。本研究對(duì)4種檢測(cè)體系的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4種檢測(cè)體系日內(nèi)精密度均小于2%；日間精密度均小于10%，回收率在92%～98%之間。就檢測(cè)的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性而言，4種檢測(cè)體系均可用于瘤胃液VFA的測(cè)定。

結(jié)果表明，以甲醇和乙腈做流動(dòng)相，對(duì)3種有機(jī)酸均能很好分離，其區(qū)別主要體現(xiàn)在出峰時(shí)間不同。用乙腈作流動(dòng)相時(shí)，3種酸的出峰時(shí)間均比甲醇作流動(dòng)相時(shí)的要短，而且特別是丁酸的出峰時(shí)間比用甲醇作流動(dòng)相時(shí)提前5min左右。但考慮到乙腈價(jià)格較高，且有毒性，本研究推薦在檢測(cè)3種有機(jī)酸時(shí)，如果時(shí)間允許，本著經(jīng)濟(jì)、安全、環(huán)保的考慮建議用甲醇做流動(dòng)相；如果時(shí)間緊，經(jīng)費(fèi)寬裕，環(huán)保設(shè)施到位，建議考慮用乙腈做流動(dòng)相；與流動(dòng)相的組成相比，流動(dòng)相的pH 只要在一定范圍內(nèi)（2.0～2.5），對(duì)3種酸的分離效果影響不大。

［1］ Phillipson A T.Physiology of digestion and metabolism in the ruminant：proceedings of the third international symposium Cambridge，England，August 1969［M］.Oriel Press，1970：432.

［2］ 李偉忠，單安山.揮發(fā)性脂肪酸在動(dòng)物體內(nèi)的作用［J］.中國(guó)飼料，2003（10）：23－31.

［3］ 李 旺.瘤胃揮發(fā)性脂肪酸的作用及影響因素［J］.中國(guó)畜牧雜志，2012，48（7）：63－66.

［4］ 楊麗杰.VFA和黏蛋白對(duì)腸道微生物和腸道疾病的影響［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2004（6）：36.

［5］ Doner L W，Cavender P J.Chiral liquid chromatography for resolving malic acid enatiomers in adulterated apple juice［J］.Food Sci，1988，53（6）：1898－1899.

［6］ Coppla E D，Starr M S.Liquid chromatographic determination of major acids in apple juice and cranberry juice cocktail collaborative study［J］.Assoc off Angl Chem，1986，69（4）：594－598.

［7］ Van Soesthergen A W，Evans R H，Ristow K A.Evaluation of apple juice authenticity by organic acid analvsis［J］.Assocoff Anal Chem，1983，66（6）：1517－1520.

［8］ 趙景嬋，郭治安，常建華，等.瘤胃揮發(fā)性脂肪酸的作用及影響因素［J］.中國(guó)畜牧雜志，2012，48（7）：63－66.

［9］ 潘惠慧，吳曉琴，陸柏益，等.高效液相色譜法分析和檢測(cè)青梅花、枝、葉中有機(jī)酸的種類和含量［J］.2008，24（3）：350－354.

［10］ 孫緒順，褚春風(fēng)，李春杰，等.反相高效液相色譜測(cè)定厭氧反應(yīng)上清液中揮發(fā)性脂肪酸［J］.凈水技術(shù)，2009，28（5）：64－66.

［11］ 宋永康，郭 嘉，潘 葳，等.影響測(cè)定反相液相色譜流動(dòng)相pH 的因素［J］.現(xiàn)代科學(xué)儀器，2005（1）：61－63.

［12］ 白冬梅，杜國(guó)民，趙學(xué)明，等.反相高效液相色譜法測(cè)定產(chǎn)琥珀酸防線桿菌發(fā)酵液中的有機(jī)酸［J］.分析化學(xué)，2003，12：1496－1499.