趙 妍 楊 超 王若蘭 宋永令

ZHAO YanYANG ChaoWANG Ruo－lanSONG Yong－ling

（河南工業(yè)大學糧油食品學院，河南 鄭州 450001）

（College of Food Science and Technology，Henan University of Technology，Zhengzhou，Henan 450001，China）

大多數果蔬產品的生產受到季節(jié)性和地域性的限制，往往集中在某一地區(qū)、某個時令大量上市，而目前中國果蔬類產品的采后保鮮系統(tǒng)還不完善，因此常常出現大量果蔬采摘后因處理不當而遭受病原微生物侵染以致腐爛變質的現象［1］。鈣鹽可以作為一種品質保護劑應用于果蔬采后保鮮，研究［2］表明其能夠減緩果實貯藏過程中品質下降速率，這對于提高果實耐貯性有著積極的作用。

中國是蘋果生產的第一大國，據聯(lián)合國糧食及農業(yè)組織統(tǒng)計，2010年中國蘋果產量為3 326萬t，接近世界總產量的一半［3］。河南省地處黃河故道，是中國蘋果的主要產區(qū)之一，因此，采后貯藏保鮮也是該地區(qū)蘋果產業(yè)中的一項重要研究課 題［3］。蘋果炭疽病是由炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）侵染所致，該病在中國北方蘋果產區(qū)普遍發(fā)生。之前的大量研究表明：采后CaCl2浸泡處理可抑制蘋果的呼吸作用，延緩蘋果衰老［4］；而采前噴施CaCl2可以增加蘋果果實鈣含量、降低苦痘病等生理病害的發(fā)病率、并顯著增加果實大小，改善著色品質［5］。但沒有關于采后應用非化學殺菌劑CaCl2防治河南省蘋果產區(qū)的炭疽病害、提高該地區(qū)果實抗病性的報道。吳芳芳等［6］研究認為CaCl2對C.gloeosporioides有一定的抑制作用，但并未對經CaCl2處理之后的蘋果果實品質及抗病性做具體研究。本試驗重點探討CaCl2處理對河南產區(qū)蘋果采后炭疽病害、貯藏品質及果實抗病性的影響，以期為該地區(qū)蘋果采后非化學殺菌劑保藏提供一定的理論指導。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和病原菌

試驗用蘋果品種為“首紅”，七、八成熟時采摘于河南省滎陽蘋果園。試驗用蘋果選取大小適中、顏色均勻、未被病蟲害侵染、表皮無機械傷的果實。

病原菌蘋果炭疽菌（C.gloeosporioides）分離于自然發(fā)病的蘋果果實，由中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC）鑒定。該菌種使用前于PDA（馬鈴薯葡萄糖瓊脂）培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)7d，試驗用孢子懸浮液用含有0.05%吐溫－20的無菌水配置，其濃度為5×104個／mL。

1.2 CaCl2 抑菌試驗

1.2.1C.gloeosporioides菌落直徑測定 根據文獻［7］測定不同濃度的CaCl2溶液（1%，2%，5%，10%）對病原菌C.gloeosporioides菌落直徑的影響。不同CaCl2濃度均做3次平行試驗。

1.2.2 孢子萌發(fā)率測定 根據文獻［7］測定不同濃度的CaCl2溶液（1%，2%，5%，10%）對病原菌C.gloeosporioides孢子萌發(fā)率的影響。不同CaCl2濃度各做3次平行試驗。

1.2.3 果實接種試驗－病斑直徑測定 首先配置1%次氯酸鈉溶液，將供試果實浸泡其中消毒1min，之后果實分別浸入濃度為1%，2%，5%，10%的CaCl2溶液中（無菌水做對照，浸泡時間為10min）。

果實晾干后于赤道部位打一3mm×3mm的傷口并將配置好的C.gloeosporioides孢子懸浮液（15μL）接種于傷口中。果實貯藏于冷藏條件下（4℃，28d）并于貯藏期結束后測量果實病斑直徑（采用十字交叉法）。每種濃度CaCl2溶液處理的果實數為30個，并做3次重復。

1.3 果實品質指標測定

蘋果果實經預處理之后置于恒溫恒濕箱中貯藏（4℃，28d），每7d取樣測定果實的可滴定酸值、VC含量、可溶性固形物含量及果實硬度。試驗所用果實數目為10個×3重復＝30個。

1.3.1 可滴定酸值 采用GB 12293－90中的電位滴定法。

1.3.2 VC含量 依據文獻［8］，采用2，4－二硝基苯肼比色法。

1.3.3 可溶性固形物含量 采用手持折光儀測定。

1.3.4 蘋果硬度測定方法 在蘋果赤道部位兩兩相對取四點，使用FT327型果實硬度計配套的削皮器去果皮，插入硬度計測量，結果取4點平均值，單位轉化為牛頓（N）。

1.4 果實病理指標測定

蘋果果實預處理之后置于恒溫恒濕箱中貯藏（4℃，28d），每7d取樣測定果實木質素、總酚、MDA（丙二醛）含量及PAL（苯丙氨酸解氨酶）活性。每處理隨機選取10個果實，整個試驗重復3次。

1.4.1 木質素含量測定 木質素在植物抗病過程中發(fā)揮重要作用，其可限制病菌酶和病原菌分泌的毒素向寄主植物的擴散，同時限制了病原菌從寄主植物吸取水分和營養(yǎng)物質。木質素測定方法參照文獻［9］并作部分修正。稱取蘋果果肉2g，加入95%乙醇研磨并離心抽濾。所余果肉殘渣放入鋁盒中干燥（105℃，1h）。干燥產物放入10mL具塞試管中，加入3mL乙酰溴－乙酸混合液（體積比1∶3），70℃下水浴30min。結束后置于冰水中、加入0.9mL濃度為2mol／L的NaOH終止反應，用冰乙酸定容至10mL。離心后取上清液0.5mL于10mL具塞試管中定容。280nm處測定吸光度，木質素含量用吸光度表示。

1.4.2 總酚含量測定 酚類化合物與植物的抗病性有密切關系，能夠抑制真菌孢子萌發(fā)和菌絲生長，還能夠鈍化真菌分泌的一些酶。總酚標準曲線以沒食子酸配制。測定方法：稱取果肉樣品1g，用70%丙酮研磨，定容至40mL后超聲15min，用旋轉蒸發(fā)儀除去丙酮，剩余勻漿離心后取上清液用乙醇定容至50mL，再吸取1mL用甲醇定容至50mL。取上清液1mL，置于25mL具塞試管內，其余操作同標準曲線制備部分，參照標準曲線計算試管中總酚含量，并按式（1）計算果實總酚含量。

式中：

R—— 總酚含量（以沒食子酸計），mg／g；

m——25mL試管中總酚含量，mg／g；

M—— 所取果肉質量，g。

1.4.3 MDA含量測定 植物衰老會導致細胞內活性氧代謝平衡被破壞，產生大量自由基，自由基毒害會引發(fā)膜脂過氧化作用，破壞細胞膜結構和功能，而 MDA是膜脂過氧化的最終產物之一。其測定方法：稱取2g蘋果果肉，加入5mL TCA溶液（100g／L），研磨勻漿后冷凍離心20min（4℃，12 000r／min），取上清液2mL置于試管中，而空白組為2mL TCA溶液。分別向試驗及空白組加入2mL濃度為0.67%的TBA，混勻煮沸20min后冷卻。取上清液分別測定其在450，532，600nm的吸光值、計算果肉樣品 MDA含量，結果以μmol／g·FW 表示。

1.4.4 PAL活性測定 PAL是植物苯丙烷類代謝途徑的關鍵酶，其活性的高低與植物抗性反應中木質素、酚類物質、植物抗毒素等的生物合成有直接關系。參照文獻［10］的方法加以改進：稱取2g蘋果果肉，加入4mL硼酸硼砂緩沖液（100mM，pH 8.7）冰浴研磨成均漿，4℃下12 000r／min冷凍離心20min，取上清液用于酶活測定。以每小時290nm吸光值增加0.01為一個酶活單位（U）。酶活性以U／g·FW（鮮重）表示。

1.5 統(tǒng)計分析

試驗數據采用SAS 8.2統(tǒng)計軟件進行鄧肯氏多重差異比較。

2 結果與分析

2.1 CaCl2對C.gloeosporioides的抑制效果

由表1可知，CaCl2對C.gloeosporioides的菌絲生長、孢子萌發(fā)以及由其侵染所造成的蘋果采后炭疽病均有明顯抑制作用。體外試驗結果顯示：當CaCl2濃度為1%時就可以顯著地抑制C.gloeosporioides的菌絲生長與孢子萌發(fā)（P＜0.05），且CaCl2濃度增大，對于C.gloeosporioides的抑制能力增強。果實接種試驗結果顯示：CaCl2濃度為2%時就可以顯著地抑制蘋果炭疽病病班直徑的擴展，當CaCl2濃度上升到10%時，該效果更加顯著（P＜0.05）。

2.2 蘋果果實貯期主要品質指標變化規(guī)律

由圖1（a）可知，隨著儲藏期的延長，各處理組蘋果果實可滴定酸值均呈下降趨勢。CaCl2處理可以減緩蘋果果實可滴定酸值的下降速率，貯藏7d之后，10%和5%濃度CaCl2處理組果實可滴定酸值分別為0.66，0.50mmol／100g，是對照的1.63和1.25倍。

表1 CaCl2對C.gloeosporioides的抑制效果?Table1 The inhibitory effect of CaCl2 to C.gloeosporioides

由圖1（b）可知，貯藏期間各組果實VC含量變化趨勢相似，均隨時間延長而逐漸下降。CaCl2處理不同程度地延緩了蘋果果實VC的下降趨勢，在貯藏期間，10%和5%濃度CaCl2處理組果實VC含量均顯著地高于對照（P＜0.05）。

貯藏期間由于果實的呼吸作用和能量消耗，可溶性固形物含量均呈緩慢下降的趨勢，CaCl2處理同樣可以延緩蘋果果實可溶性固形物的下降趨勢，且該效果與CaCl2使用濃度呈正相關（圖1（c））。

蘋果果實采摘后內部乙烯含量上升，后熟作用漸強，呼吸作用增大，分解和消耗更多的有機物和糖類，果實漸漸衰老，硬度減小。由圖1（d）可知，CaCl2處理對于維持蘋果果實硬度效果顯著，整個貯藏期間除了前7d，1%CaCl2處理組果實硬度與對照組無顯著差異之外，其余各組果實硬度均顯著地高于對照（P＜0.05），同樣的，該效果與CaCl2使用濃度呈正相關。

圖1 CaCl2對蘋果貯期可滴定酸、VC、可溶性固形物含量和硬度的影響Figure1 Influence of CaCl2on the titratable acidity，vitamin C，soluble solids contents and firmness of apple fruit

2.3 蘋果果實貯期抗病性相關指標變化規(guī)律

由圖2（a）可知，各組木質素含量均呈上升趨勢，在第14天時達到峰值，之后緩慢下降。整個貯藏期間，對照組木質素含量始終處于最低水平。在第14～28天時，各濃度CaCl2處理組果實其木質素含量均顯著地高于對照，其中尤以10%濃度CaCl2處理的效果最為顯著（P＜0.05）。

由圖2（b）可知，各組果實總酚含量均在貯期的第14天達到峰值，之后迅速下降。在第14～28天時，經10%濃度CaCl2處理的果實其總酚含量始終維持在最高水平，顯著地高于對照和其它3個CaCl2處理組（P＜0.05）。

CaCl2處理顯著地提高了蘋果果實貯期PAL活性，由圖2（c）可知，在第14～28天時，各個CaCl2處理組果實其PAL活性均顯著地高于對照（P＜0.05），且該效果與CaCl2的使用濃度呈正相關。

由圖2（d）可知，各處理組果實MDA含量在第7天均達到峰值，推測是由于冷藏環(huán)境造成果實應激條件下積累大量活性氧，進而攻擊自身細胞膜，產生膜脂過氧化產物所致。其中，對照組 MDA含量最高，為1.84μmol／g·FW，顯著高于10%及5%濃度CaCl2處理組（P＜0.05）。隨后的第7～21天，各組果實MDA含量迅速下降，而貯藏末期（第21～28天）均有不同程度的回升，尤以對照組變化明顯，其MDA含量顯著地高于其它各組（P＜0.05），這可能是由于貯藏末期果實衰老，品質下降所致。

圖2 CaCl2對蘋果貯期木質素、總酚、MDA含量及PAL活性的影響Figure2 Influence of CaCl2on the content of lignin，total phenolic，MDA and PAL activity of apple fruit

3 結論

（1）CaCl2對C.gloeosporioides有一定的抑制作用，體外試驗中可以顯著抑制其菌絲生長與孢子萌發(fā)，體內試驗則可以顯著降低其對蘋果果實的侵染能力，且該效果與其使用濃度呈明顯正相關關系。蘋果果實在貯藏期內主要品質指標均隨時間推移而下降，但CaCl2處理能夠明顯減緩果實品質下降趨勢，該效果同樣與CaCl2使用濃度正相關。10%濃度CaCl2處理可以誘導蘋果果實PAL活性升高并顯著減少MDA積累以保護細胞膜通透性，同時果實木質素與總酚含量均顯著高于對照，與之相應的是蘋果果實對于炭疽病的防御能力增強。

（2）隨著貯藏期的延長，果實逐漸衰老，主要品質指標如可滴定酸、VC、可溶性固形物含量下降，但CaCl2處理能夠延緩其下降速率，這和前人的研究結論［11］相一致，主要是由于外源鈣能抑制呼吸基質的代謝，降低線粒體活力，從而降低果實的呼吸作用，延緩果實的衰老。此外，CaCl2處理能夠增加蘋果果實硬度，該試驗結果與對于其它果蔬的研究結論［12，13］相一致。之前的研究結果證實：PAL是植物苯丙烷類代謝途徑的關鍵酶，其活性升高會促進木質素、酚類物質等的生物合成［14］，而果實傷口處細胞壁沉積的木質素及酚類物質會在傷口處形成屏障，阻止水分散失、病原菌入侵或對病原菌有直接毒性［15］。本研究表明CaCl2處理可以誘導蘋果果實PAL活性上升、木質素及總酚含量升高，并增強對C.gloeosporioides侵染的抵御能力，該結果符合前人的研究結論并進一步豐富了相關理論知識。

（3）本試驗主要研究了CaCl2處理對河南地區(qū)蘋果采后炭疽病的防治效果，而對其它可能發(fā)生的采后病害如輪紋病、黑星病等未做研究，今后將加大研究范圍；此外，本研究采用的蘋果果實儲藏條件為4℃，并未對常溫貯藏條件下的相應指標進行測定，今后將補充完善本部分內容；最后，本試驗研究表明CaCl2處理可以誘導蘋果果實采后抗病性，但并未對誘導機理從分子水平進行闡明，今后擬將采用基因組學的分析方法細致深入的探討蘋果采后抗病性的誘導機理。

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